【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及一种在细胞基因组精准插入dna的方法。
技术介绍
1、crispr/cas系统2013年首次在真核细胞中实现定点切割，随后碱基编辑、引导编辑等多种类型的基因编辑工具被陆续开发，并在农业领域展现出巨大的应用价值。然而，目前在植物基因组精准插入外源dna还存在一些难题。目前主要有以下几种策略实现dna插入，一、利用同源重组介导的细胞内源修复途径；二、利用非同源末端连接介导的修复途径；三、利用转座酶的转座活性；四、利用逆转录酶活性介导的引导编辑系统；五、近年来还发展出引导编辑与序列特异性重组酶联用的大片段插入方法。这些方法各有其优缺点。
2、在植物中利用非同源末端连接修复途径介导的大片段dna定点插入技术已有多项成功案例，创制了抗除草剂水稻、富含β-胡萝卜素的营养加强型水稻等植物材料。这种方法利用cas9/sgrna复合体在基因组上定点产生双链断裂，随后递送进细胞的线性双链dna插入双链断裂之间。细胞通过非同源末端连接的方式将供体dna和基因组之间的破损进行修复。但是，由这种方法产生的dna大片段插入并不精准。首先，外源递送的供体片段dna两端会受到细胞内源的外切等过程的处理。第二，cas9/sgrna复合体产生的基因组dna双链断裂会产生不可预测的插入或删除。第三，供体dna插入基因组的方向和拷贝数都是随机的。因此，即使在双链供体dna两端加入化学修饰，也会有很大比例的不精准插入产生。
3、引导编辑是一种精准的编辑方式，核心组分包括cas9(h840a)、逆转录酶(mlv)以及pe
4、而其他在植物中实现dna插入的方法也各有优缺点，如同源重组虽然精准但在植物细胞中效率太低；转座酶在植物中报道较少；引导编辑与序列特异性重组酶联用可以插入较长片段，但会在基因组上留下重组酶识别位点。因此，还需要开发更加高效精准的植物基因组dna定点插入技术。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种在细胞基因组精准插入dna的方法以及专用基因编辑器。
2、本专利技术利用引导编辑系统(pe)，使用逆转录模板上带有插入序列部分片段的pegrna，在基因组上产生3’单链dna悬垂。同时，提供带有3’单链悬垂的外源供体dna。供体dna的3’悬垂与基因组的3’悬垂进行碱基互补配对，从而实现精准的修复，以达到精准插入的目的。
3、第一方面，本专利技术要求保护一种用于基因编辑的核酸组件。
4、本专利技术要求保护的用于基因编辑的核酸组件，由pegrna和供体dna组成；
5、所述供体dna为一端是平齐末端，另一端存在3’端垂悬的双链dna；
6、所述pegrna中的rtt序列与所述供体dna中的3’端垂悬部分的序列一致。
7、如本领域技术人员所熟知的，所述pegrna包含间隔序列(spacer)、grna骨架序列、rtt序列(逆转录模板)和pbs序列(引物结合位点)，根据需要3’端还可包含结构基序(tevopreq1)，其作用是以形成工程化的pegrna(epegrna)进一步增强pegrna 3’末端的稳定性防止其被降解。
8、进一步地，在所述供体dna中，所述3’端垂悬部分的核苷酸长度为3-15nt；更进一步地，所述3’端垂悬部分的核苷酸长度为9-15nt(如12nt或9nt)。
9、在本专利技术的一些实施案例中，所述供体dna中的3’端垂悬部分的核苷酸序列为gatgacgacgataag(未经修饰的)；所述pegrna中的rtt序列为gaugacgacgauaag。相应地，所述pegrna的序列如seq id no.4、seq id no.6、seq id no.7、seq idno.8、seq id no.9、seq id no.10或seq id no.11所示；和/或，所述供体dna由seq id no.12和seq id no.13所示两条单链dna退火后形成。
10、在本专利技术的另一些实施案例中，所述供体dna中的3’端垂悬部分的核苷酸序列为gtctgatccagagcc(未经修饰的)；所述pegrna中的rtt序列为gucugauccagagcc。相应地，所述pegrna的序列如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3或seq idno.5所示；和/或，所述供体dna由seq id no.14和seq id no.15所示两条单链dna退火后形成。
11、进一步地，所述供体dna可为经过修饰的供体dna。所述修饰可为如下任一：仅进行磷酸修饰；仅进行硫代修饰；既进行磷酸修饰又进行硫代修饰。
12、更进一步地，所述磷酸修饰为对组成所述供体dna的两条链的5’末端均进行磷酸化修饰；和/或，所述硫代修饰为对组成所述供体dna的两条链的两端均进行两个硫代修饰。
13、在本专利技术的一个实施案例中，所述供体dna为如下任一：(1)由seq id no.16和seqid no.17所示两条单链dna退火后形成；(2)由seq id no.18和seq idno.19所示两条单链dna退火后形成；(3)由seq id no.20和seq id no.21所示两条单链dna退火后形成；(4)由seq id no.22和seq id no.23所示两条单链dna退火后形成。
14、在上述本专利技术所要求保护的用于基因编辑的核酸组件的基础上，本领域技术人员能够预料到的变形形式也属于本专利技术的保护范围。如将所述供体dna设计成两端都具有3’端悬垂的结构，同时所述pegrna设计为一对(即两个)，两个pegrna中的rtt序列分别对应所述供体dna两端的悬垂部分。
15、第二方面，本专利技术要求保护一种基因编辑器。
16、本专利技术所要求保护的基因编辑器包括前文第一方面中所述的核酸组件和如下蛋白组件：cas蛋白、逆转录酶。
17、进一步地，所述cas蛋白为具有完整核酸酶活性的cas蛋白，可为cas9蛋白，如spcas9蛋白。所述逆转录酶可为删除rnase h结构域，并融合病毒核衣壳蛋白(nucleocapsid，nc)的m-mlv逆转录酶。
18、第三方面，本专利技术要求保护一种用于基因编辑的成套产品。
19、本专利技术要求保护的用于基因编辑的成套产品，包括：
20、(a1)用于表达前文第一方面中所述pegrna的表达载体；
21、(a2)前文第一方面中所述供体dna。
22、进一步地，所述成套产品还可包括如下(本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于基因编辑的核酸组件，由pegRNA和供体DNA组成；
2.根据权利要求1所述的核酸组件，其特征在于：在所述供体DNA中，所述3’端垂悬部分的核苷酸长度为3-15nt；
3.根据权利要求1或2所述的核酸组件，其特征在于：所述供体DNA中的3’端垂悬部分的核苷酸序列为SEQ ID No.12的第22-36位，对应的所述pegRNA中的RTT序列为SEQ ID No.12的第22-36位；或，所述供体DNA中的3’端垂悬部分的核苷酸序列为SEQ ID No.15的第22-36位，对应的所述pegRNA中的RTT序列为SEQ ID No.15的第22-36位；
4.根据权利要求1-3中任一所述的核酸组件，其特征在于：所述供体DNA经过修饰；所述修饰为如下任一：仅进行磷酸修饰；仅进行硫代修饰；既进行磷酸修饰又进行硫代修饰；
5.一种基因编辑器，包括权利要求1-4中任一所述的核酸组件和如下蛋白组件：Cas蛋白、逆转录酶；
6.一种用于基因编辑的成套产品，包括：
7.权利要求1-4中任一所述的核酸组件或权利要求
8.一种对基因组进行基因编辑的方法，包括如下步骤：将权利要求1-4中任一所述的核酸组件或权利要求5所述基因编辑器或权利要求6所述成套产品导入受体，从而实现对所述受体的基因组进行基因编辑。
9.根据权利要求7所述的应用或权利要求8所述方法，其特征在于：所述对基因组进行基因编辑为在基因组的特定位点插入目的DNA片段；
10.根据权利要求7-9中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述受体选自如下任一：植物细胞、动物细胞、原生质体、植物组织、动物组织、植物、动物或微生物。
...【技术特征摘要】
1.一种用于基因编辑的核酸组件，由pegrna和供体dna组成；
2.根据权利要求1所述的核酸组件，其特征在于：在所述供体dna中，所述3’端垂悬部分的核苷酸长度为3-15nt；
3.根据权利要求1或2所述的核酸组件，其特征在于：所述供体dna中的3’端垂悬部分的核苷酸序列为seq id no.12的第22-36位，对应的所述pegrna中的rtt序列为seq id no.12的第22-36位；或，所述供体dna中的3’端垂悬部分的核苷酸序列为seq id no.15的第22-36位，对应的所述pegrna中的rtt序列为seq id no.15的第22-36位；
4.根据权利要求1-3中任一所述的核酸组件，其特征在于：所述供体dna经过修饰；所述修饰为如下任一：仅进行磷酸修饰；仅进行硫代修饰；既进行磷酸修饰又进行硫代修饰；
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【专利技术属性】
技术研发人员：高彩霞，雷源，陈璐，
申请(专利权)人：中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：
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