【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，具体涉及一株突变的尿酸酶原核表达工程菌的构建方法。
技术介绍
1、尿酸(uric acid,ua)是嘌呤的代谢产物，它在血清中的溶解度极低，尿酸酶(ec1.7.3.3，尿酸氧化酶)是一种能够催化尿酸氧化成尿囊素的酶，然而在进化过程中，灵长类动物编码尿酸酶的基因发生了假基因化，导致人类自身缺乏功能性的尿酸酶，无法转化尿酸。正常的尿酸浓度对于人体是无害的，但现代社会的高能量、高嘌呤饮食习惯很容易打破体内的尿酸平衡，导致血清中尿酸浓度超标而患高尿酸血症。因此，构建高产尿酸酶的基因表达工程菌，外源引入尿酸酶，对于治疗高尿酸血症具有重要意义。
2、目前，已有多种来源的尿酸酶基因被克隆和表达。例如，大豆根瘤特有的尿酸酶基因被克隆，该基因包含约9个碱基，编码区被七个内含子隔开，编码8个氨基酸。此外，也有丝状真菌来源的尿酸酶基因被克隆，该基因编码8个氨基酸，含有两个短的内含子。近年来在产尿酸酶菌株的商业化生产中的主要微生物有黄曲霉、产朊假丝酵母以及枯草芽孢杆菌。大肠杆菌是遗传背景清晰、成本低廉的基因工程宿主菌，利用大肠杆菌并积极开发具有更高生物活性的尿酸酶编码基因，对于高产尿酸酶的基因表达工程菌的规模化应用奠定了良好的基础。
技术实现思路
1、针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一株突变的尿酸酶原核表达工程菌的构建方法，本专利技术通过将来源于黄曲霉菌的尿酸酶编码基因序列进行突变，并根据大肠杆菌的遗传密码子偏爱性，结合原核翻译起始序列的局部二级结构自由能最小化
2、为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、本专利技术第一方面，提供了一种尿酸酶突变体，所述尿酸酶突变体由将来源于黄曲霉菌的野生型尿酸酶第15位、第60位、第117位和第228位的氨基酸突变所得，所述野生型尿酸酶的氨基酸序列如seq id no.1所示，具体如下：
4、seq id no.1：
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6、所述野生型尿酸酶的编码基因核苷酸序列如seq id no.2所示，具体如下：
7、seq id no.2：
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9、具体的，所述尿酸酶突变体由来源于黄曲霉菌的野生型尿酸酶第15位氨基酸由精氨酸突变为赖氨酸、第60位氨基酸由丝氨酸突变为苏氨酸、第117位氨基酸由组氨酸突变为丝氨酸和第228位氨基酸由缬氨酸突变为异亮氨酸所得；尿酸酶突变体氨基酸序列如seqid no.3所示，具体如下：
10、msavkaarygkdnvkvykvhkdektgvqtvyemtvcvllegeietsytkadnsvivatdtikntiyitakqnpvtppelfgsilgthfiekynhihaahvnivchrwtrmdidgkpsphsfirdseekrnvqvdvvegkgidiksslsgltvlkstnsqfwgflrdeyttlketwdrilstdvdatwqwknfsglqevrshvpkfdatwatarevtlktfaednsasiqatmykmaeqilarqqlietveyslpnkhyfeidlswhkglqntgknaevfapqsdpnglikctvgrsslkskl*。
11、本专利技术第二方面，提供了上述尿酸酶突变体的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列存在4处活性位点突变，包括：第15位氨基酸编码序列cgc突变为aag、第60位氨基酸编码序列tcc突变为aca、第117位氨基酸编码序列cac突变为tcg和第228位氨基酸编码序列gtg突变为atc；将突变后的尿酸酶编码基因命名为uox2，所述uox2编码基因的核苷酸序列如seq id no.4所示，具体如下：
12、atgtccgcagtaaaagcagcccgctacggcaaggacaatgtcaaggtctacaaggttcacaaggacgagaagaccggtgtccagacggtgtacgagatgaccgt本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种尿酸酶突变体，其特征在于，所述尿酸酶突变体由将来源于黄曲霉菌的野生型尿酸酶第15位、第60位、第117位和第228位的氨基酸突变所得，所述野生型尿酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述野生型尿酸酶的编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的尿酸酶突变体，其特征在于，所述尿酸酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.一种权利要求2所述尿酸酶突变体的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.权利要求3所述的编码基因在构建产尿酸酶的基因工程菌中的应用。
5.一种产尿酸酶的原核表达工程菌，其特征在于，所述原核表达工程菌含有权利要求3所述的编码基因。
6.一种权利要求5所述的原核表达工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述重组表达载体构建方法为：将权利要求3所述的编码基因连接至pET28(a)质粒载体上，获得重组表达载体。
8.根据权利要求6所述的构
9.权利要求5所述的原核表达工程菌在制备预防或者治疗高尿酸血症的酶制剂中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述预防或者治疗高尿酸血症的酶制剂以权利要求5所述的原核表达工程菌作为活性成分。
...【技术特征摘要】
1.一种尿酸酶突变体，其特征在于，所述尿酸酶突变体由将来源于黄曲霉菌的野生型尿酸酶第15位、第60位、第117位和第228位的氨基酸突变所得，所述野生型尿酸酶的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述野生型尿酸酶的编码基因核苷酸序列如seq id no.2所示。
2.根据权利要求1所述的尿酸酶突变体，其特征在于，所述尿酸酶突变体氨基酸序列如seq id no.3所示。
3.一种权利要求2所述尿酸酶突变体的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no.4所示。
4.权利要求3所述的编码基因在构建产尿酸酶的基因工程菌中的应用。
5.一种产尿酸酶的原核表达工程菌，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：卢志明，成士清，高华，孙冠军，董雯，周东，
申请(专利权)人：山东第一医科大学附属省立医院山东省立医院，
类型：发明
国别省市：
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