【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，特别涉及一种分析生物样本中蛋白质的碘化修饰水平及其修饰位点鉴定的分析方法。
技术介绍
1、蛋白质修饰的研究在蛋白功能研究过程受到了高度的重视，常见的蛋白质修饰包括磷酸化、糖基化、泛素化、亚硝基化、甲基化、乙酰化、脂质化等。通过在蛋白质的一个或多个氨基酸残基上加入修饰基团，可以改变蛋白质的物理、化学性质，进而影响蛋白质的空间构象、活性、定位、以及蛋白间的相互作用。蛋白质的修饰在多种细胞过程中起到关键作用。蛋白质的磷酸化修饰常与细胞信号传导密切相关，泛素化修饰与蛋白质的降解相关，甲基化与蛋白的转录翻译相关，蛋白糖基化与糖尿病、肿瘤的病变相关。本专利技术首次提供了蛋白质的碘化修饰水平及其修饰位点分析方法。为探索蛋白质碘化修饰及生物学功能提供了技术手段。cn202110047611.1公开了利用紫外光源产生的紫外光直接作用于含有水溶性氯化盐、溴化盐或碘化盐的蛋白质溶液，从而对芳香族氨基酸进行直接卤化修饰，避免了常规芳香族氨基酸卤化反应体系中的各种复杂的催化剂、配体以及苛刻的反应条件。然而，蛋白质的卤化修饰方法和修饰效率，蛋白质的碘化修饰的检测，蛋白质的碘化修饰水平的检测还有待进一步的开发提升。
技术实现思路
1、本申请的目的是提供一种生物样本中蛋白质的碘化修饰水平及其修饰位点的分析方法。
2、为实现上述目的，本专利技术采用了以下技术方案：
3、本专利技术的第一个方面，本专利技术提供了一种蛋白碘化修饰水平的分析方法，所述方法包括：将目标蛋白酸水解，
4、在一些实施例中，蛋白碘化修饰水平的分析方法包括：将目标蛋白酸水解，水解成单一氨基酸，调ph至碱性，然后利用衍生化试剂处理，衍生化处理后检测测定其中的一碘化酪氨酸和二碘化酪氨酸含量，其中碘化酪氨酸的含量即为目标蛋白的碘化修饰水平。
5、在本专利技术中，优选的，所述衍生化处理为采用sptpp((5-n-succinimidoxy-5-oxopentyl)-triphenylphosphonium bromide)对水解产物衍生化处理。采用超高效液相色谱-四级杆质谱仪评估目标蛋白碘化修饰水平。
6、在一些实施例中，目标蛋白是从待检生物样本中提取出来的。优选的，所述目标蛋白是通过免疫共沉淀将目标蛋白从待测生物样品中提取出来。
7、在一些实施例中，所述酸水解中使用的酸为强酸；优选的，所述强酸为盐酸。。
8、在一些实施例中，所述酸水解为使用盐酸进行水解。优选的，盐酸酸水解的盐酸浓度为6n，目标蛋白溶液与盐酸的体积比为1:1，酸水解温度为110℃，酸水解时间为20小时；酸水解后样品经氢氧化钠调节ph至8.0，并经sptpp衍生化后进行质谱分析。
9、在一些实施例中，采用超高效液相色谱-四级杆质谱仪评估目标蛋白碘化修饰水平，其中，(1)uplc液相条件：色谱柱为poroshell hph-c18，柱长100mm；流动相梯度采用甲醇(a)和超纯水(b)，其梯度变化为0-1min，30％ a；1-15min，30％-60％ a；15-17min，60％-75％ a；17-18min，75％-100％ a；18-26min，100％ a；26.1-30min，30％ a；流动相流速为0.3ml/min；柱温为35℃，进样量为2-10μl。(2)质谱条件：离子源为：esi源；数据扫描方式：正离子模式；脱溶剂气温度为500℃；毛细管电压为3kv；脱溶剂气流量为1000l/hr；源温度为150℃；测定方式：选择反应监测方式(mrm)。
10、本专利技术的第二个方面，本专利技术提供了一种蛋白质碘化位点的分析方法，所述方法包括：
11、(4)利用碘盐-芬顿反应对目标蛋白进行碘化化学修饰；
12、(5)将化学修饰后的目标蛋白用酶解消化，并对消化的肽段进行富集；
13、(6)将获得的需要检测的目标蛋白肽段进行高分辨质谱数据采集，对采集的质谱信息分析，获得目标蛋白碘化修饰位点信息。
14、优选的，在本专利技术中，所述碘化化学修饰为酪氨酸的碘化修饰。
15、在一些实施例中，所述碘盐为碘化钠。
16、在一些实施例中，所述目标蛋白是从待检生物样本中提取出来的。优选的所述生物样本为细胞样本或组织样品。
17、在本专利技术中，可以对生物样本采用破碎、裂解、离心、层析方式中的一种或多种使得目标蛋白从生物样本中释放分离出来。破碎的方式包括液氮冷冻破碎、超声破碎、组织细胞提取器破碎、反复冻融破碎中的一种或多种。
18、在一些实施例中，将待测生物样本在细胞裂解液中进行裂解并经超声破碎使细胞中蛋白释放至细胞裂解液中。
19、优选地，为保证目标蛋白在提取过程中不被环境中的蛋白酶水解，在细胞裂解液中加入蛋白酶抑制剂和磷酸化酶抑制剂。
20、优选地，超声破碎过程中将样品置于低温条件下超声，防止蛋白在细胞超声破碎过程中变性或降解。
21、在一些实施例中，所述目标蛋白是通过免疫共沉淀将目标蛋白从裂解的待测生物样本中提取出来。
22、在一些实施例中，从待测生物样本提取的总蛋白浓度为不低于1mg/ml蛋白浓度。
23、在一些实施例中，蛋白化学碘化修饰步骤包括：将获得的目标蛋白与碘化钠在过氧化氢环境下经亚铁离子催化反应，该碘化修饰可将蛋白中可碘化修饰的酪氨酸进行加碘修饰，从而增强其在质谱分析过程中的碘化修饰位点的鉴定几率。
24、在一些实施例中，本专利技术的蛋白质碘化修饰步骤包括：将目标蛋白溶解至50μl的pbs溶液中，向目标蛋白中加入100μl的1m碘化钠溶液、30μl的1.5％过氧化氢溶液和30μl的5mm硫酸亚铁溶液。
25、在一些实施例中，所述酶解消化为采用胰蛋白酶、碱性内切蛋白酶、蛋白酶k、羧肽酶b中的一种多种蛋白酶解试剂进行酶解。
26、在一些实施例中，高分辨质谱数据采集为采用串联质谱仪q-exactive orbitrap将样品进行full-ms-ddms2采集模式分析，对top20信号进行二级图谱采集，采集2小时质谱数据。碘化修饰蛋白质谱数据解析软件为使用商业化的maquant、proteome discoverer或mascot。
27、本专利技术的有益效果如下：
28、(1)本专利技术技术采用质谱检测分析，可对碘化修饰肽段进行精准定量分析并解析其碘化修饰水平。同时本专利技术的蛋白质碘化修饰技术，增强碘化位点识别，同时基于衍生后技术可提升碘化肽段分析检测灵敏度，降低分析过程中的基质干扰提升方法的抗干扰能力，进而实现非靶向的蛋白碘化修饰进行位点鉴定。
29、(2)本专利技术首次提供了蛋白质的碘化修饰水平及其修饰位点分析方法，为探索蛋白质碘化修饰及功能提供了技术手段。
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1.一种蛋白碘化修饰水平的分析方法，其特征在于，所述方法包括：将目标蛋白酸水解，调pH至碱性，对水解产物衍生化处理，检测测定水解后的蛋白中碘化酪氨酸含量，其中碘化酪氨酸的含量即为目标蛋白的碘化修饰水平。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述衍生化处理为使用衍生化试剂SPTPP对水解产物进行衍生化处理。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，蛋白质酪氨酸的碘化修饰；所述酸水解为采用强酸水解；优选的，所述强酸为盐酸。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述检测为采用超高效液相色谱-四级杆质谱仪，其中(1)UPLC液相条件：色谱柱为Poroshell HPH-C18，柱长100mm；流动相梯度采用：A相甲醇和B相超纯水，其梯度变化为0-1min，30％A；1-15min，30％-60％A；15-17min，60％-75％A；17-18min，75％-100％A；18-26min，100％A；26.1-30min，30％A；流动相流速为0.3mL/min；柱温为35℃，进样量为2-10μl；(2)质谱条件：离子源为：ESI源；数据
5.一种蛋白质碘化位点的分析方法，其特征在于，所述方法包括：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述碘化化学修饰为酪氨酸的碘化修饰；优选的，所述碘盐为碘化钠。
7.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述碘化化学修饰的步骤包括：将获得的目标蛋白与碘化钠在过氧化氢环境下经亚铁离子催化反应，将蛋白中可碘化修饰的酪氨酸进行加碘修饰。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，酶解消化为采用胰蛋白酶、碱性内切蛋白酶、蛋白酶K、羧肽酶B中的一种多种蛋白酶解试剂进行酶解。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，高分辨质谱数据采集为采用串联质谱仪Q-Exactive Orbitrap将样品进行Full-MS-ddMS2采集模式分析，对TOP20信号进行二级图谱采集，采集2小时质谱数据。
...【技术特征摘要】
1.一种蛋白碘化修饰水平的分析方法，其特征在于，所述方法包括：将目标蛋白酸水解，调ph至碱性，对水解产物衍生化处理，检测测定水解后的蛋白中碘化酪氨酸含量，其中碘化酪氨酸的含量即为目标蛋白的碘化修饰水平。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述衍生化处理为使用衍生化试剂sptpp对水解产物进行衍生化处理。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，蛋白质酪氨酸的碘化修饰；所述酸水解为采用强酸水解；优选的，所述强酸为盐酸。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述检测为采用超高效液相色谱-四级杆质谱仪，其中(1)uplc液相条件：色谱柱为poroshell hph-c18，柱长100mm；流动相梯度采用：a相甲醇和b相超纯水，其梯度变化为0-1min，30％a；1-15min，30％-60％a；15-17min，60％-75％a；17-18min，75％-100％a；18-26min，100％a；26.1-30min，30％a；流动相流速为0.3ml/min；柱温为35℃，进样量为2-10μ...
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