【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医药生物领域，尤其涉及一种glp-1药物孵育的间充质干细胞外泌体的制备及应用方法。
技术介绍
1、急性心肌梗死是全球范围内致死率致残率最高的的心血管疾病，早期治疗对于预防心肌坏死、降低死亡率和减轻痛苦等方面具有非常重要的意义，目前，治疗急性心肌梗死主要分为药物治疗、介入治疗和外科手术等多种方案，药物治疗方面，可采用抗血小板治疗、抗凝、维持血压、降低心肌耗氧等治疗方案，介入治疗中的经皮冠状动脉介入技术(pci)是有效治疗手段，疗效可靠，手术安全性高，并能在短时间内恢复心肌供血，降低心肌坏死面积，达到抢救生命的作用，然而，当前的治疗方案仍然存在一些潜在的缺陷，然而，心肌梗死后，部分心肌细胞死亡，留下的心肌组织可能无法再生，因此心肌梗死造成的并发症相对较多，最常见的是心力衰竭，心脏收缩功能下降，心脏的排血功能减弱，身体的组织得不到足够的血液供应，出现体循环淤血及肺循环淤血症状，严重影响患者的生存质量；其次，心肌死亡和组织的坏死可能会引发心律失常，如心房颤动、室性心动过速，严重时甚至可能导致猝死；第三，心肌重构也较为常见，心肌梗死后，细胞死亡的区域会逐渐被瘢痕组织所代替，这些瘢痕组织的弹性很差，心肌重构中的瘢痕形成可能会导致心室壁的扩张和心室功能下降。
2、近年来发展起来的干细胞疗法被认为是治疗心肌梗死的有前景的新方法。干细胞有能力分化成各种类型的细胞，包括心肌细胞，因此可以被用于重建心肌。研究表明干细胞治疗可以在心肌梗死后培育心肌细胞来修复坏死区域。但目前干细胞治疗心肌梗死的长期效果尚未得到证明，而且可能存在
3、外泌体是一种双层磷脂膜包裹的纳米级囊泡，干细胞外泌体含有细胞的生物活性成分，例如蛋白质、rna和小分子物质等，其作用与造成其难以存活并有高治愈率的干细胞有些相似，但避免了普通干细胞植入时的免疫排斥和可能的遗传性传染病等安全性问题，在心肌梗死中，干细胞外泌体与干细胞治疗相比表现出更多的优势，干细胞外泌体可促进心肌生长和修复，增加坏死区域中心肌细胞的数量，并提高其代谢活性，其通过加强细胞自噬机制和促进血管再生发挥作用；其次，心肌梗死时炎症反应和纤维化是造成心肌损伤和重建的原动力，干细胞外泌体可通过其透明质酸水解酶、凋亡调节因子、mirna等减轻毒性免疫细胞的生成，减缓炎症反应和纤维化程度，同时干细胞外泌体具有抗氧化、抗凋亡、抗炎等多项保护效应，可以减轻心肌细胞的损伤并促进细胞再生，总之，干细胞外泌体可以通过多种途径促进心肌再生和修复，同时也更加安全的、避免可能遗传疾病的风险，但因为干细胞外泌体的研究还比较浅显，其在心肌梗死治疗中使用须进一步的研究。
4、脂肪间充质干细胞是一种来源广泛的干细胞，具有许多优势：1、丰富的来源：adscs可以从成年人的脂肪组织中很容易地分离和提取，因此获得adscs比从骨髓中提取髓系干细胞要更容易；2、干细胞浓度高：adscs的浓度比神经干细胞等其它类型的干细胞提取出来的浓度要高达100倍以上；3、多潜能：adscs能够分化成除神经细胞之外的任何细胞类型，在恰当的培养条件下，可以分化成脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞和心肌细胞等；4、抗炎作用：adscs能够抑制过度炎症，可用于炎症相关疾病的治疗；5、缺少免疫原性：adscs缺少配型抗原，所以不会引发免疫反应；6、安全性高：adscs提取过程中不需要使用外科手术，非常安全，同时可以非常适合规模生产及大规模使用；因为这些优点，adscs在多个医疗领域的应用不断扩大；在心血管病治疗中，adscs已被证明可以具有修复血管、加速损伤部位的治愈、改善血管增生和心肌重构等作用，adscs可以在心肌缺血和再灌注损伤后长期存活，体内部位远离注射部位，因此具有治疗类型更广泛的优势，因为其容易获取和安全性高，同时可以在多个前沿领域进行研究和后续应用，因此adscs在心肌损伤治疗中是一个非常有前途的选择。
5、glp-1是一种胰高血糖素样多肽-1，在调控胰岛素分泌、参与能量代谢等方面发挥着重要的作用，近期研究表明glp-1对心肌细胞也具有保护作用，并且glp-1可以促进干细胞移植后的干细胞成活，因而被认为是治疗心肌梗死的潜在治疗策略之一，动物实验证明了glp-1孵育干细胞治疗心肌梗死是安全有效的，总之，通过glp-1孵育干细胞治疗心肌梗死的治疗方案在实践上已经产生了相当的优异效果，其关键是将两个活性组分配合，生物材料技术为避免免疫应答创造了理想的微环境，以提高干细胞的成活率和治愈效果，glp-1孵育的干细胞外泌体在心肌缺血中的应用尚未见报道，研究表明干细胞治疗可以在心肌梗死后培育心肌细胞来修复坏死区域，但目前干细胞治疗心肌梗死的长期效果尚未得到证明，而且可能存在安全性和生物伦理学问题，需要进一步的大规模的临床试验来确认干细胞疗法治疗心肌梗死的效果和安全性。
6、因此，有必要提供一种glp-1药物孵育的间充质干细胞外泌体的制备及应用方法解决上述技术问题。
技术实现思路
1、本专利技术提供一种glp-1药物孵育的间充质干细胞外泌体的制备及应用方法，解决了研究表明干细胞治疗可以在心肌梗死后培育心肌细胞来修复坏死区域，但目前干细胞治疗心肌梗死的长期效果尚未得到证明，而且可能存在安全性和生物伦理学问题，需要进一步的大规模的临床试验来确认干细胞疗法治疗心肌梗死的效果和安全性的问题。
2、为解决上述技术问题，本专利技术提供的一种glp-1药物孵育的间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：s1：准备材料，准备人体脂肪为手术后废弃的正常人体脂肪、pbs、bsa、iv型胶原酶、胎牛血清、cd29+、cd44+、cd90+、cd34-和cd45-的单克隆抗体；
3、s2：人脂肪间充质干细胞的分离；
4、s21：无菌条件下收集脂肪组织约15ml，去除脂肪组织表面的结缔组织包膜及血管；
5、s22：迅速剪碎至糊状，加入不含外泌体的培养基，过滤后收集滤液；
6、s23：将获得的滤液以1500r/min离心15min，弃上清，得到沉淀；
7、s24：将沉淀用37℃pbs轻轻吹打清洗2～3遍，再向沉淀中加入培养基重悬，检测细胞活性后，以2～6×104cells/cm2的密度接种，放置于培养箱中培养，培养12～14h后，首次换液，换液动作要轻，防止刚贴壁的细胞被换下，之后每48h更换1次新鲜培养基并用电镜观察细胞形态；
8、s3：细胞表面标志蛋白检测；显微镜下观察细胞状态及细胞融合度，待细胞状态良好且融合度超过95％时，消化细胞，待细胞边缘开始脱离培养板后，加入培养基中止消化，离心后取沉淀，再用新鲜培养基重悬细胞调整细胞浓度，准备多个离心管，分别加入含1×106个细胞的细胞悬液，再分别加入粘附分子受体表达标记物cd29+和cd44+、干细本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种GLP-1药物孵育的间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：准备材料，准备人体脂肪为手术后废弃的正常人体脂肪、PBS、BSA、IV型胶原酶、胎牛血清、CD29+、CD44+、CD90+、CD34-和CD45-的单克隆抗体；
2.根据权利要求1所述的一种GLP-1药物孵育的间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述不含外泌体的培养基加入3mL，不含外泌体的培养基中包含终浓度为0.06～0.16％的IV型胶原酶和0.015～0.02％的BSA，37℃恒温120r/min振荡消化30～35min，随时观察组织消化状态，期间每隔5～8min取出混匀，终止消化后用100目和200目筛网依次过滤，去除未消化组织。
3.根据权利要求1所述的一种GLP-1药物孵育的间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述培养基含体积分数为10％的无外泌体的胎牛血清。
4.根据权利要求1所述的一种GLP-1药物孵育的间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述培养箱室内条件为37℃、5％CO2、100％相对湿度。
5.根据权
6.根据权利要求1所述的一种GLP-1药物孵育的间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述无外泌体的血清培养基在37℃、5％CO2条件下开始培养。
7.根据权利要求1所述的一种GLP-1药物孵育的间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述无人脂肪间充质干细胞外泌体的血清培养基内含有300μmol/L二甲基乙二酰基甘氨酸。
8.一种根据权利要求1-7任一项所述的GLP-1药物孵育的间充质干细胞外泌体的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：制备大鼠心肌梗死模型及外泌体注射；将SD大鼠随机分为：Sham组、AMI组、ExoBMSCs组，腹腔注射麻醉，暴露大鼠颈部气管，气管插管连接呼吸机辅助呼吸，于大鼠胸部左侧第3、4肋骨间手术切口1cm，暴露心脏，在左冠状动脉前降支起始部，采用5-0针线进行结扎，缺血处理30min后，剪开丝线恢复血流灌注；
9.根据权利要求8所述的一种GLP-1药物孵育的间充质干细胞外泌体的应用方法，其特征在于，所述麻醉时在腹腔注射戊巴比妥钠(30mg/kg)。
10.根据权利要求8所述的一种GLP-1药物孵育的间充质干细胞外泌体的应用方法，其特征在于，所述呼吸机的呼吸频率为90次/min，潮气量为8mL，呼吸比为1∶2。
...【技术特征摘要】
1.一种glp-1药物孵育的间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1：准备材料，准备人体脂肪为手术后废弃的正常人体脂肪、pbs、bsa、iv型胶原酶、胎牛血清、cd29+、cd44+、cd90+、cd34-和cd45-的单克隆抗体；
2.根据权利要求1所述的一种glp-1药物孵育的间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述不含外泌体的培养基加入3ml，不含外泌体的培养基中包含终浓度为0.06～0.16％的iv型胶原酶和0.015～0.02％的bsa，37℃恒温120r/min振荡消化30～35min，随时观察组织消化状态，期间每隔5～8min取出混匀，终止消化后用100目和200目筛网依次过滤，去除未消化组织。
3.根据权利要求1所述的一种glp-1药物孵育的间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述培养基含体积分数为10％的无外泌体的胎牛血清。
4.根据权利要求1所述的一种glp-1药物孵育的间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述培养箱室内条件为37℃、5％co2、100％相对湿度。
5.根据权利要求1所述的一种glp-1药物孵育的间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述10nmol/l glp-1对人脂肪干细胞分别孵育4...
【专利技术属性】
技术研发人员：何洁琼，陈军，陈巍，林泰武，
申请(专利权)人：深圳市宝安区人民医院，
类型：发明
国别省市：
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