【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于病害鉴定，具体涉及一种香榧黑斑病病原菌的鉴定方法。
技术介绍
1、香榧的种仁富含优质脂肪酸、蛋白质及多种微量元素，具有极高的营养价值，尤其是其坚果部分，具有独特的风味，受到市场的广泛欢迎。
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4、尽管香榧在市场上展现出了巨大的经济潜力，但其种植和加工过程中存在的病害问题，尤其是香榧黑斑病，已成为影响香榧品质和产量的主要因素之一。香榧树的生长过程中，病虫害的发生严重影响了香榧的外观质量和食用价值，甚至可能导致产量的显著下降。黑斑病作为香榧生产中的一种常见病害，已成为影响香榧品质的主要因素之一，尤其是在加工过程中，对香榧的外观和口感造成了极大的损害。
5、香榧的生产过程中，采摘的时机、后熟处理的方式以及气候条件等因素都可能影响病害的发生。具体来说，香榧的后熟期(即青蒲阶段)是病害高发期。在后熟过程中，由于香榧果实内外环境的湿度较高，容易滋生各类病原菌，导致种壳表面出现霉斑、黑斑等问题。此外，由于香榧种仁和种衣的特殊成分——如单宁等，这使得香榧种子对病原菌的感染具有一定的易感性，进一步加剧了香榧的病害发生。
6、目前，香榧黑斑病的发生常常伴随着种仁腐烂、空心籽等现象的发生，严重影响香榧的外观和品质。这不仅影响了香榧的市场竞争力，也使得种植者面临着巨大的经济损失。在一些地区，由于缺乏有效的防治措施，黑斑病的发生已经成为香榧产业发展中的瓶颈问题。
7、香榧黑斑病的典型症状表现为果实表面出现黑色斑点，这些斑点通常为圆形或不规则形状，且随着病害的发
8、香榧黑斑病的发生不仅影响果实外观，还可能导致香榧的种仁质量降低。由于香榧种仁内含大量的脂肪和蛋白质，受到病害的侵染后，这些营养成分可能被病原菌降解，造成种仁软腐、发霉或空心籽的现象，进一步降低其食用价值和商业价值。黑斑病还会导致香榧的炒制加工过程变得更加复杂，增加了生产成本和加工难度。
9、尽管香榧黑斑病已成为影响香榧品质的主要病害之一，但目前针对该病害的系统研究仍相对匮乏。国内外关于香榧病害的研究大多集中于栽培管理、栽培环境的优化等方面，而对香榧黑斑病的具体病原菌、发病机制及防治措施的研究较为薄弱，尤其是在病原菌鉴定与致病机理方面，现有研究尚未给出明确的答案。
10、在香榧病害的研究中，关于黑斑病的病原菌并未得到足够的关注。现有文献大多没有对香榧黑斑病的病原进行系统的鉴定和分类，导致了病害防治工作的盲目性与不确定性。虽然一些研究表明，香榧黑斑病可能与霉菌、细菌等微生物的感染有关，但具体的病原菌种类及其致病机制仍然不清楚。此外，现有的防治技术也多停留在简单的农药喷洒和物理防治等层面，缺乏基于病原菌特性的精准防治措施。
11、基于上述背景，本申请提供了一种香榧黑斑病病原菌的鉴定方法，用以快速分离、鉴定病原菌。
技术实现思路
1、本专利技术的目的就在于为了解决上述问题而提供一种结构简单，设计合理的香榧黑斑病病原菌的鉴定方法。
2、本专利技术通过以下技术方案来实现上述目的：
3、一种香榧黑斑病病原菌的鉴定方法，该方法包括以下步骤，
4、步骤s102，获得香榧感病黑斑籽；
5、基于种壳和种衣进行组织分离法获得病原菌菌株；
6、获得病原菌形态鉴定数据；
7、步骤s104，获得病原菌的rdna-its、tub和tef基因序列特征，获得病原菌的鉴定结果；
8、步骤s106，基于病原菌的生物特性，获得病原菌的生物学特性；
9、其中，所述生物学特性包括适宜温度值、适宜ph值以及适合的碳氮源。
10、作为本专利技术的进一步优化方案，获得病原菌菌株，于预设频率下分离种壳和种衣，活化后于菌落边缘取直径5mm菌饼，接种到不同处理培养基平板中央，每皿1片，每处理重复3皿，25℃恒温培养箱中培养2d，采用十字交叉法测量菌落直径，获得菌落的形态特征；对试验数据进行单因子方差分析，并进行差异显著性检测。
11、作为本专利技术的进一步优化方案，种壳和种衣分离频率分别为76.92％和60％。
12、作为本专利技术的进一步优化方案，获得病原菌菌株，采用组织分离法对病原菌进行分离以及纯化，将种籽外壳用75％乙醇进行表面消毒，无菌水冲洗3次后，在黑斑处切取大小为5×5mm左右的种壳和种衣组织块，置于pda培养基上，25℃培养，以预设次数纯化，获得编号为xfhk3的病原菌。
13、作为本专利技术的进一步优化方案，将纯化的菌株接种于pda培养基上，25℃培养，观察记录菌落的颜色、形态、表面特征，并记录分生孢子颜色、大小，获得xfhk3病原菌的形态学数据。
14、作为本专利技术的进一步优化方案，获得燕麦枝条碎粒培养基，于燕麦枝条碎粒培养基内25℃光暗交替培养，对分离菌株进行产孢诱导，再挑取分生孢子器于载玻片上压破后采集孢子的形态学数据。
15、作为本专利技术的进一步优化方案，采集健康、洁净的香榧种籽，用75％乙醇进行表面消毒，再用无菌水冲洗干净，将处理好的种籽置于铺有保湿无菌滤纸的培养皿中，用打孔器从培养的菌落上打取菌饼，将菌饼贴至香榧种壳中部，以pda培养基块做对照，每个重复9个种籽，每种处理3个重复，持续观察种籽是否感病及发病症状并做好记录，最后，对接种病原菌的种籽再次分离发病组织，获得分离菌的致病性数据。
16、作为本专利技术的进一步优化方案，将纯化的菌株接种于pda培养基上培养，收集菌丝体，采用ezup柱式真菌基因组dna抽提取试剂盒提取分离纯化的致病菌株的dna，首先选择引物its1/its4对its基因扩增，比对后初步确定病原菌种属，再进一步选取引物bt2a/bt2b和ef1-688f/ef1-986r对菌株的tub和tef基因进行pcr扩增，获得测序结果并进行同源性比对分析，比对获得序列，剪切后将多基因拼接构建系统发育树。
17、作为本专利技术的进一步优化方案，获得通用引物its1/its4对选择的代表菌株xfhk3进行pcr扩增，序列测定后将获得的序列比对，并根据扩增的各菌株特异保守序列分子序列进行多重序列比对，构建分子系统发育树，完成对病原菌xfhk3的鉴定。
18、本专利技术的有益效果在于：
19、本专利技术通过组织分离法获得病原菌菌株，对病原菌进行了形态鉴定，经柯赫氏法则对病菌的致病性进行验证，分析其rdna-its、tef和tub基因序列特征，以期明确香榧黑斑病的致病菌，为香榧黑斑病的发病规律及防控措施的制定提供理论依据。
20、本专利技术提供的香榧黑斑病病原菌的特异引物，为病原菌的快速、准确鉴定提供可行方案；采用特异引物对菌落进行确认，可以快速鉴别病原菌。本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种香榧黑斑病病原菌的鉴定方法，其特征在于，该方法包括以下步骤，
2.根据权利要求1所述的一种香榧黑斑病病原菌的鉴定方法，其特征在于：通过组织分离法，分离种壳和种衣，获得病原菌菌株，活化后于菌落边缘取直径5mm菌饼，接种到不同处理培养基平板中央，每皿1片，每处理重复3皿，25℃恒温培养箱中培养2d，采用十字交叉法测量菌落直径，获得菌落的形态特征；对试验数据进行单因子方差分析，并进行差异显著性检测。
3.根据权利要求2所述的一种香榧黑斑病病原菌的鉴定方法，其特征在于：该种菌在种壳和种衣分离频率分别为76.92％和60％。
4.根据权利要求2所述的一种香榧黑斑病病原菌的鉴定方法，其特征在于：获得病原菌菌株，采用组织分离法对病原菌进行分离以及纯化，将种籽外壳用75％乙醇进行表面消毒，无菌水冲洗3次后，在黑斑处切取大小为5×5mm左右的种壳和种衣组织块，置于PDA培养基上，25℃培养，以预设次数纯化，获得编号为XFHK3的病原菌。
5.根据权利要求4所述的一种香榧黑斑病病原菌的鉴定方法，其特征在于：将纯化的菌株接种于PDA培养基上，25
6.根据权利要求5所述的一种香榧黑斑病病原菌的鉴定方法，其特征在于：获得燕麦枝条碎粒培养基，于燕麦枝条碎粒培养基内25℃光暗交替培养，对分离菌株进行产孢诱导，再挑取分生孢子器于载玻片上压破后采集孢子的形态学数据。
7.根据权利要求1所述的一种香榧黑斑病病原菌的鉴定方法，其特征在于：采集健康、洁净的香榧种籽，用75％乙醇进行表面消毒，再用无菌水冲洗干净，将处理好的种籽置于铺有保湿无菌滤纸的培养皿中，用打孔器从培养的菌落上打取菌饼，将菌饼贴至香榧种壳中部，以PDA培养基块做对照，每个重复9个种籽，每种处理3个重复，持续观察种籽是否感病及发病症状并做好记录，最后，对接种病原菌的种籽再次分离发病组织，获得分离菌的致病性数据。
8.根据权利要求1所述的一种香榧黑斑病病原菌的鉴定方法，其特征在于：将纯化的菌株接种于PDA培养基上培养，收集菌丝体，采用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提取试剂盒提取分离纯化的致病菌株的DNA，首先选择引物ITS1/ITS4对ITS基因扩增，比对后初步确定病原菌种属，再进一步选取引物Bt2a/Bt2b和EF1-688F/EF1-986R对菌株的TUB和TEF基因进行PCR扩增，获得测序结果并进行同源性比对分析，比对获得序列，剪切后将多基因拼接构建系统发育树。
9.根据权利要求8所述的一种香榧黑斑病病原菌的鉴定方法，其特征在于：获得通用引物ITS1/ITS4对选择的代表菌株XFHK3进行PCR扩增，序列测定后将获得的序列比对，并根据扩增的各菌株特异保守序列分子序列进行多重序列比对，构建分子系统发育树，完成对病原菌XFHK3的鉴定。
...【技术特征摘要】
1.一种香榧黑斑病病原菌的鉴定方法，其特征在于，该方法包括以下步骤，
2.根据权利要求1所述的一种香榧黑斑病病原菌的鉴定方法，其特征在于：通过组织分离法，分离种壳和种衣，获得病原菌菌株，活化后于菌落边缘取直径5mm菌饼，接种到不同处理培养基平板中央，每皿1片，每处理重复3皿，25℃恒温培养箱中培养2d，采用十字交叉法测量菌落直径，获得菌落的形态特征；对试验数据进行单因子方差分析，并进行差异显著性检测。
3.根据权利要求2所述的一种香榧黑斑病病原菌的鉴定方法，其特征在于：该种菌在种壳和种衣分离频率分别为76.92％和60％。
4.根据权利要求2所述的一种香榧黑斑病病原菌的鉴定方法，其特征在于：获得病原菌菌株，采用组织分离法对病原菌进行分离以及纯化，将种籽外壳用75％乙醇进行表面消毒，无菌水冲洗3次后，在黑斑处切取大小为5×5mm左右的种壳和种衣组织块，置于pda培养基上，25℃培养，以预设次数纯化，获得编号为xfhk3的病原菌。
5.根据权利要求4所述的一种香榧黑斑病病原菌的鉴定方法，其特征在于：将纯化的菌株接种于pda培养基上，25℃培养，观察记录菌落的颜色、形态、表面特征，并记录分生孢子颜色、大小，获得xfhk3病原菌的形态学数据。
6.根据权利要求5所述的一种香榧黑斑病病原菌的鉴定方法，其特征在于：获得燕麦枝条碎粒培养基，于燕麦枝条碎粒培养基内25℃光暗交替培养，对分离菌株...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡渊渊，宋丽丽，吴家胜，喻卫武，刘涛，叶浩杰，赖思思，谢凌皓，方南寿，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：
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