【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物制药，具体涉及一种无百日咳组分抗原残留的菌毛蛋白fim2/3的纯化方法。
技术介绍
1、百日咳(pertussis,whoopingcough)是由百日咳杆菌所引起的一种急性呼吸道传染病，主要发生在儿童和青少年中，感染后可引起痉咳、室息、紫绀、呕吐等强烈症状，严重者会造成死亡。百日咳曾是引起世界范围内婴儿死亡的主要疾病之一。随着全细胞百日咳疫苗(whole cell pertussis vaccine,wpv)与白喉类毒素、破伤风类毒素联合制备的百白破联合疫苗的大规模接种，百日咳疾病的发生显著性降低。然而，近年来国际上报道了新的百日咳流行病学现象——百日咳重现，一些高疫苗接种率的地区仍然陆续出现了百日咳复发流行，并且咳发病率呈现上升趋势(参考文献：nieves dj,heininger u.bordetella pertussis.microbiolspectr.2016jun；4(3).doi:10.1128/microbiolspec.ei10-0008-2015.pmid:27337481.)。
2、百日咳杆菌，属鲍特杆菌属(bordetella)，革兰染色呈阴性，两端着色较深，有荚膜，无鞭毛。百日咳杆菌表达100多种蛋白，包含有多种抗原，如百日咳毒素(pertussistoxin，pt)、丝状血凝素(filamentous hemagglutinin，fha)、百日咳粘着素(pertactin,prn)、百日咳菌毛(fimbriae,fim)等。其中pt是百日咳杆菌引起发病的关键毒力因子，同
3、zhang等人早在1985年公开了fim蛋白的纯化方法(参考文献：zhang jm,cowelljl,steven ac,carter ph,mcgrath pp,manclark cr.purification andcharacterization of fimbriae isolated from bordetella pertussis.infectimmun.1985 may；48(2):422-7.doi:10.1128/iai.48.2.422-427.1985.pmid:2859248；pmcid:pmc261332.)。该方法首先通离心获得菌体，将其重悬于磷酸盐缓冲液中冰浴匀浆裂解处理，离心后收集的上清用24％的硫酸铵进行盐析沉淀，沉淀溶解于ph9.5的tris溶液中并透析；之后离心收集上清，上清中的fim通过透析到ph6.0的磷酸盐溶液中发生沉淀，通过20min，27000g离心收集沉淀，并将沉淀溶解于tris溶液；通过加入0.1m氯化镁再次进行沉淀，20min，27000g离心后将沉淀收集并溶解于ph9.5的tris溶液中。
4、康诺特实验室有限公司申请了纯化菌毛的专利(cn100387618c)。该方法主要步骤：对百日咳杆菌进行匀浆处理，并用10mm磷酸钾，150mm氯化钠和4m尿素进行抽提；离心获得上清后，使用100-300kda滤器进行浓缩，并在75-85℃温度下保温10-60分钟；离心获得上清后，加入4.5％的peg8000并持续搅拌30分钟；离心收取的沉淀用磷酸盐缓冲液溶解，通过septhadex 6b或pei硅胶柱进行纯化。对于fim2/3抗原的获得，主要还是采用沉淀法进行纯化。
5、长春百克生物科技股份公司申请了去除百日咳菌毛蛋白2/3中内毒素的专利(cn110358802a)。该方法将百日咳菌体经含尿素的磷酸盐缓冲液抽提、上清液用peg-8000和硫酸铵(不分先后)进行沉淀抽提、再经历q-sepharose层析纯化，得到不含内毒素的fim2/3。
6、武汉生物制品研究所有限责任公司公布了一种百日咳菌毛蛋白的纯化方法(cn112341528a)。百日咳菌体用适宜的方法处理得到prn粗纯液，经层析后收集流穿液，流穿液样品经硫酸铵沉淀抽提和capto adhere层析(不分先后)收集流穿液样品，最后通过羟基磷灰石材料层析柱制备出百日咳菌毛蛋白。
7、以上所述方法步骤繁多，最终得到的百日咳菌毛蛋白纯度较低，无法彻底去除百日咳的pt、prn、fha等其他杂质蛋白。尤其是pt蛋白，其为百日咳杆菌的关键毒性因子，其在菌毛蛋白中的残留会引起严重的安全性问题，不可直接用于多组分疫苗的制备。因此，需要改进和提升大规模连续制备高纯度菌毛蛋白的生产工艺。
技术实现思路
1、为了解决现有技术中存在的不足，本专利技术的目的是提供一种不含百日咳毒素pt等杂质残余的高纯度百日咳菌毛蛋白fim2/3的方法。更具体而言，本专利技术的目的是提供一种稳定、高效地提取无百日咳毒素pt、百日咳丝状血凝素fha、百日咳黏附素prn等杂质的百日咳菌毛蛋白fim2/3纯化方法，该方法能够有效避免因百日咳毒素pt残余而不得不采取的脱毒工艺。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：
3、本专利技术一方面提供了一种去除本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种去除百日咳组分抗原的百日咳菌毛蛋白Fim2/3的纯化方法，其包括：
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其中，步骤(1)中第一溶液的pH为8.5至9.0，优选pH8.8；
3.根据权利要求1所述的纯化方法，其中，步骤(2)中热浸提的温度为60℃～65℃，优选为60℃；
4.根据权利要求1所述的纯化方法，其中，步骤(3)中所述的硫酸盐包括硫酸铵、硫酸钠，优选地，所述的硫酸盐为硫酸铵，优选地，所述的硫酸铵的浓度≥15.3％(w/v)，优选地，所述的硫酸铵的浓度为15.3～19.2％(w/v)，更为优选地，所述的硫酸铵的浓度为15.3％(w/v)。
5.根据权利要求1所述的纯化方法，其中，步骤(4)中所述的阴离子交换层析采用Sepharose DEAE柱，
6.根据权利要求1所述的纯化方法，其中，步骤(5)中所述的阳离子交换层析采用CaptoSPImpRes柱，
7.根据权利要求1所述的纯化方法，其中，步骤(6)中所述的多模式阴离子复合层析采用Capto Adhere柱，优选地，所述的Capto Adhere
8.根据权利要求1-7任一项所述的纯化方法，其中，步骤(4)中阴离子交换层析的平衡液的pH为8.5～9.0，步骤(5)中阳离子交换层析的平衡液的pH为4.5～5.0，步骤(6)中的多模式阴离子复合层析的平衡液的pH为7.5～8.5；
9.一种百日咳菌毛蛋白Fim2/3，其中，所述的百日咳菌毛蛋白Fim2/3是采用权利要求1-8任一项所述的纯化方法获得。
10.根据权利要求9所述的百日咳菌毛蛋白Fim2/3，其中，所述的百日咳菌毛蛋白Fim2/3的分子量为22kDa至23kDa。
...【技术特征摘要】
1.一种去除百日咳组分抗原的百日咳菌毛蛋白fim2/3的纯化方法，其包括：
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其中，步骤(1)中第一溶液的ph为8.5至9.0，优选ph8.8；
3.根据权利要求1所述的纯化方法，其中，步骤(2)中热浸提的温度为60℃～65℃，优选为60℃；
4.根据权利要求1所述的纯化方法，其中，步骤(3)中所述的硫酸盐包括硫酸铵、硫酸钠，优选地，所述的硫酸盐为硫酸铵，优选地，所述的硫酸铵的浓度≥15.3％(w/v)，优选地，所述的硫酸铵的浓度为15.3～19.2％(w/v)，更为优选地，所述的硫酸铵的浓度为15.3％(w/v)。
5.根据权利要求1所述的纯化方法，其中，步骤(4)中所述的阴离子交换层析采用sepharose deae柱，
6.根据权利要求1所述的纯化方法，其中，...
【专利技术属性】
技术研发人员：张云涛，马昱，刘明，杨柏峰，董晓飞，张彤，李欣雨，陶含章，刘丽娜，梁晶，
申请(专利权)人：北京生物制品研究所有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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