【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及病源性微生物检测，具体为能特异性识别和检测十足目虹彩病毒1的dnazyme及其应用。
技术介绍
1、近年来虾类养殖过程中病害频发，导致产量下降，经济损失大。其中，病毒病是对虾养殖业中的主要病害，是影响对虾养殖业发展的主要因素之一。
2、十足目虹彩病毒1(decapod iridescentvirus 1，div1)属于虹彩病毒科，是一种呈二十面体对称结构的双链dna病毒，它在十足目甲壳类动物中传播速度快、宿主范围广，主要分布于沿海虾蟹养殖区。感染div1的对虾死亡率极高，临床症状包括：肝胰腺和肌肉组织中出现嗜碱性包涵体和核固缩，对虾会出现游水、趴边、身体微红及空胃的症状。目前，对于div1尚无可用的药物治疗，国内外对div1的治理以综合预防为主，即尽早发现疾病并采取相应措施是控制该病毒扩散的重要途径。
3、传统检测对虾是否感染div1的方法主要包括：病理学显微镜观察、生化测定、免疫学试验、细胞培养等。这些方法耗时、操作复杂，很难适应现场快速检测的需要。
4、脱氧核酶(deoxyribozymes，dnazymes)是通过指数富集的配体进化技术(selex)体外筛选被分离出来的，通常由一条底物链和一条酶链组成，这两条dna链通过碱基配对进行部分互补杂交，形成一个双链系统。目的靶标的存在激活了dna酶的活性，底物链上的核苷酸(ra)被裂解，dnazyme可以通过构象变化和级联反应完成信号的传导和放大，使其在作为生物传感器时可以进行高灵敏的检测。此外，dnazyme还具有良好的稳定性、
5、本专利技术利用selex技术筛选出能特异性识别div1的dnazyme，并设计了一种基于dnazyme特异性识别div1的生物传感器。通过优化其反应条件，获得了特异性高、灵敏度好的检测div1生物传感器，可以快速检测水产致病微生物div1。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是针对现有技术的缺陷，提供能特异性识别和检测十足目虹彩病毒1的dnazyme及其应用，以解决上述
技术介绍
提出的问题。
2、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：能特异性识别和检测十足目虹彩病毒1的dnazyme，包括一条dnazyme mcp-1的脱氧核糖核苷酸序列：
3、所述mcp-1为:5’-gaaaagtgttatccggggaaagatcatcgtactgtt atctccgagccggtcgaccagcatcggtaggcgtatct-3’。
4、作为本专利技术的一种优选技术方案，所述dnazyme序列的在3’端上有标记淬灭集团。
5、一种能特异性识别和检测十足目虹彩病毒1的dnazyme的筛选方法，采用磁珠selex法筛选dnazyme。
6、作为本专利技术的一种优选技术方案，具体步骤如下：
7、步骤1：实验所用的文库、引物、质粒由自己设计并于上海生工合成；
8、步骤2：将包含十足目虹彩病毒1的衣壳蛋白序列的质粒转入工程菌中，诱导表达并纯化回收，使用同样的方法从空载工程菌中得到反筛粗蛋白；
9、步骤3：将步骤2所得粗蛋白进行粗蛋白浓度的检测，分装于1.5ml无菌ep管，-20℃储存备用；
10、步骤4：将中心区域含有40个随机碱基和两端分别有20个固定碱基数的初始文库与引物通过pcr反应进行连接，引入ra切割位点和生物素标签，切胶回收dna；
11、步骤5：将步骤4所得pcr产物和链霉亲和素包被的磁珠在30℃下连接30min；
12、步骤6：连接结束后磁性分离弃去上清，磁珠用亲和素反应缓冲液清洗三次；
13、步骤7：用0.2m的naoh洗涤磁珠2次，磁性分离以制备单链；
14、步骤8：超纯水清洗磁珠3次，使ph值接近于中性；
15、步骤9：将10μg的十足目虹彩病毒1的衣壳蛋白(溶于50mm的pbs缓冲液，ph8.0)与等体积的2×筛选缓冲液混合，30℃孵育1h，发生切割反应，磁性分离，醇沉法回收上清液；
16、步骤10：以步骤9所得产物为模板，加入带有生物素的引物进行pcr扩增，用于下一轮筛选；
17、步骤11：将第九轮所得的pcr产物高通量测序并进行dna序列分析；
18、步骤12：候选dnazyme活性及性质检测；
19、步骤13：用海藻糖及普鲁兰多糖固定dnazyme复合物在聚乙烯96孔板中。
20、作为本专利技术的一种优选技术方案，在dna序列的5’端标记生物素；dna与磁珠结合，切割反应，醇沉回收均在1.5ml无菌ep管中进行；
21、使用超微量紫外分光光度计检测dna浓度。
22、作为本专利技术的一种优选技术方案，使用荧光信号检测仪检测dnazyme切割荧光的强度。
23、作为本专利技术的一种优选技术方案，dnazyme筛选过程中使用的磁珠直径为0.5μm。
24、一种能特异性识别和检测十足目虹彩病毒1的dnazyme体系在水产品检测中的应用。
25、一种能特异性识别和检测十足目虹彩病毒1的dnazyme在制备能够快速检测十足目虹彩病毒1的生物传感器中的应用。
26、一种能特异性识别和检测十足目虹彩病毒1的试剂盒，所述试剂盒含有dnazyme。
27、与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术通过selex技术筛选得到的dnazyme制备成dnazyme体系从而能更高特异性、高灵敏度识别div1，并且dnazyme的热化学稳定性高、易于合成和修饰、成本低廉，不仅方便与核酸扩增等信号放大手段配合，也易使用各种信号转导机制集成到荧光等分析报告系统中。采用本专利技术的一种基于dnazyme的生物传感器来快速检测水产品的div1，方法简单，便于操作。因此，本专利技术在div1的检测中具有良好的应用前景。
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1.一种能特异性识别和检测十足目虹彩病毒1的DNAzyme，其特征在于：包括一条DNAzyme MCP-1的脱氧核糖核苷酸序列：
2.根据权利要求1所述的能特异性识别和检测十足目虹彩病毒1的DNAzyme，其特征在于：所述DNAzyme序列的在3’端上有标记淬灭集团。
3.一种如权利要求1-2任一项所述的能特异性识别和检测十足目虹彩病毒1的DNAzyme的筛选方法，其特征在于：采用磁珠SELEX法筛选DNAzyme。
4.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于：具体步骤如下：
5.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于：在DNA序列的5’端标记生物素；DNA与磁珠结合，切割反应，醇沉回收均在1.5mL无菌EP管中进行；使用超微量紫外分光光度计检测DNA浓度。
6.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于：使用荧光信号检测仪检测DNAzyme切割荧光的强度。
7.根据权利要求4所述筛选方法，其特征在于：DNAzyme筛选过程中使用的磁珠直径为0.5μm。
8.一种如权利要求1-2任一项所述的能特
9.一种如权利要求1-2任一项所述的能特异性识别和检测十足目虹彩病毒1的DNAzyme在制备能够快速检测十足目虹彩病毒1的生物传感器中的应用。
10.一种能特异性识别和检测十足目虹彩病毒1的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有权利要求1-2任一项所述的DNAzyme。
...【技术特征摘要】
1.一种能特异性识别和检测十足目虹彩病毒1的dnazyme，其特征在于：包括一条dnazyme mcp-1的脱氧核糖核苷酸序列：
2.根据权利要求1所述的能特异性识别和检测十足目虹彩病毒1的dnazyme，其特征在于：所述dnazyme序列的在3’端上有标记淬灭集团。
3.一种如权利要求1-2任一项所述的能特异性识别和检测十足目虹彩病毒1的dnazyme的筛选方法，其特征在于：采用磁珠selex法筛选dnazyme。
4.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于：具体步骤如下：
5.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于：在dna序列的5’端标记生物素；dna与磁珠结合，切割反应，醇沉回收均在1.5ml无菌ep管中进行；使...
【专利技术属性】
技术研发人员：王淑军，张帅，江君，张磊，吕明生，李思盈，
申请(专利权)人：江苏海洋大学，
类型：发明
国别省市：
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