【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医用材料制备，具体涉及鹿角-dcb@evsabpcs骨移植材料的制备方法，还涉及鹿角-dcb@evsabpcs骨移植材料。
技术介绍
1、骨损伤是全球最常见的致残性损伤之一，超过4亿患者遭受此类损伤的急性或长期后果，严重影响了个人的生活质量。骨再生不是一个独立的骨骼生长过程，而是一个复杂而动态的过程，涉及骨骼、血管和神经结构的协调生长，并因剧烈的免疫反应而变得复杂。在过去十年中，通过整合细胞、生长因子和生物材料，在开发各种骨移植方面取得了重大进展。然而，目前工程骨移植的临床整合率仍然很低，缺乏一种一次性的骨移植构建略，导致在实现有效骨再生方面仍存在未解决的挑战。现有生物医用材料无法实现低免疫原性、高安全性、高修复率以及生物活性高的实际要求。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供鹿角-dcb@evsabpcs骨移植材料的制备方法，解决了现有天然骨移植物中存在的免疫排斥反应以及生物活性不足的问题。
2、本专利技术的另一目的是提供鹿角-dcb@abpcs-evs骨移植材料。
3、本专利技术所采用的第一个技术方案是，鹿角-dcb@evsabpcs骨移植材料的制备方法，具体按照以下步骤实施：
4、步骤1，制备antler-dcb支架；
5、步骤2，制备10%hama的水凝胶与abpcs-evs；
6、步骤3，取等体积的含有10%hama的水凝胶与abpcs-evs进行混合；
7、步骤4，取antle
8、步骤5，取出含10%hama的水凝胶的antler-dcb并暴露于405nm的紫外光下30秒，获得dcb@abpcs-evs骨移植材料， -80℃下冷冻保存。
9、本专利技术的第一技术方案的特点还在于，步骤1具体步骤为：
10、s1，将鹿角松质骨切成4×4mm的骨样品，反复冷冻和融化后采用超声波处理；
11、s2，将s1超声波处理后的骨样品浸泡在乙醇中摇床振荡3小时；
12、s3，将s2浸泡后的骨样品浸泡在乙醚中摇床振荡1.5小时；
13、s4，将s3浸泡后的骨样品浸泡在质量浓度为20g/l的氢氧化钠溶液中摇床振荡12小时，浸泡后使用流动水清洗骨样品3小时，清洗后使用质量分数为30%过氧化氢处理24小时，处理后再次清洗；
14、s5，将清洗后的骨样品放入体积比3:1的氯仿和甲醇混合物中1小时后用蒸馏水冲洗骨样品后，在70℃下干燥1天，生产出antler-dcb。
15、s1中超声波处理具体为：使用40khz超声波将骨样品处理20min。
16、s4中再次清洗具体为：使用流动水清洗骨样品3次，每次0.5小时，随后将骨样品浸泡在含有1mg/ml的dnase溶液中48小时，再次清洗后将样品浸泡在含有0.5mg/mlrnase的溶液中48小时，流动水清洗3次，每次0.5小时。
17、步骤2中制备hama水凝胶具体步骤为：
18、a1，取10mlpbs缓冲液，加入装有0.025glap的瓶中，以40-50℃水浴加热溶解15分钟，期间振荡数次，制得引发剂标准溶液，
19、a2，取所需质量的甲基丙烯酰化透明质酸放入容器中；取所需体积的引发剂标准溶液加入到含有甲基丙烯酰化透明质酸的容器中，室温搅拌溶解0.5-1h后将溶液加热到80℃，持续30分钟；再转移至冰水混合物中浸泡5min，得到hama水凝胶。
20、a2中hama水凝胶包括hama、锂苯基磷酸盐与去离子水，hama、锂苯基磷酸盐与去离子水体积比例为10:0.25:89.75。
21、步骤2中制备abpcs-evs具体步骤为：
22、b1，获取鹿角脱落后3-7天的胚芽组织；
23、b2，将胚芽组织切成0.2毫米见方的组织块；
24、b3，使用pbs缓冲液清洗切好的组织块3次；
25、b4，将清洗后的组织块放入i型：ⅱ型：ⅲ型胶原酶体积比为1:1:1消化液中，在37°c下消化30分钟；
26、b5，将消化后的组织块转移到10厘米的培养皿中进行原代细胞培养，当细胞密度达到80%时，进行流式细胞分选，得到分离后的细胞；
27、b6，将b5分离后的细胞与抗体cd31、cd45、cd235a共孵育，并进行流式分选，收集含有cd31-cd45- cd235a-的细胞；
28、b7，将b6收集含有cd31-cd45- cd235a-的细胞消化并离心，将分离后的细胞与abpcs标志抗体cx43和抗体fgfr2共同孵育，并进行流式分选，收集abpcs，并采用含有10%fbs缓冲液的dmem完全培养基进行培养；
29、b8，将b7培养后的abpcs以1.6×106个细胞接种于75cm²培养瓶中，在含有10%去除evs的fbs的完全培养基中培养48小时；
30、b9，培养完成后使用cck-8试剂盒评估细胞活力，收集细胞活力超过90%的培养上清液；
31、b10，将b9收集的上清液以750g离心20分钟后，以2000g离心30分钟；再次将上清液以16,000g离心70分钟，去除上清，得到evsabpcs，evsabpcs重悬于预冷的pbs中，再次以16,000g离心70分钟，进一步纯化evs；
32、b11，将钝化后的evsabpcs重悬于100µl预冷的pbs中，采用nta检测evsabpcs浓度，-80℃下冷冻保存。
33、本专利技术所采用的另一技术方案是，鹿角-dcb@evsabpcs骨移植材料的制备方法制得的鹿角-dcb@abpcs-evs骨移植材料。
34、本专利技术的有益效果是；
35、本专利技术的鹿角-dcb@evsabpcs骨移植材料及制备方法，将evs-abpc复合水凝胶注入antler-dcb中，从而为移植材料提供了多种生活活性分子，同时表现出强大地招募内源性干细胞的能力，并赋予他们类似于abpcs的表型和分子特征，使antler-dcb获得了调节成骨、血管生成、神经生成和免疫反应的强大能力，从而为治疗严重骨缺损提供了潜在治疗干预措施。
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1.鹿角-DCB@EVsABPCs骨移植材料的制备方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：
2.如权利要求1所述的鹿角-DCB@EVsABPCs骨移植材料的制备方法，其特征在于，所述步骤1具体步骤为：
3.如权利要求2所述的鹿角-DCB@EVsABPCs骨移植材料的制备方法，其特征在于，S1中超声波处理具体为：使用40kHz超声波将骨样品处理20min。
4.如权利要求2所述的鹿角-DCB@EVsABPCs骨移植材料的制备方法，其特征在于，S4中再次清洗具体为：使用流动水清洗骨样品3次，每次0.5小时，随后将骨样品浸泡在含有1mg/mL的DNase溶液中48小时，再次清洗后将样品浸泡在含有0.5mg/mLRNase的溶液中48小时，流动水清洗3次，每次0.5小时。
5.如权利要求1所述的鹿角-DCB@EVsABPCs骨移植材料的制备方法，其特征在于，步骤2中所述制备HAMA水凝胶具体步骤为：
6.如权利要求5所述的鹿角-DCB@EVsABPCs骨移植材料的制备方法，其特征在于，A2中所述HAMA水凝胶包括HAMA、锂苯基
7.如权利要求1所述的鹿角-DCB@EVsABPCs骨移植材料的制备方法，其特征在于，步骤2中所述制备ABPCs-Evs具体步骤为：
8.如权利要求1-7任一项所述的鹿角-DCB@EVsABPCs骨移植材料的制备方法制得的鹿角-DCB@ABPCs-EVs骨移植材料。
...【技术特征摘要】
1.鹿角-dcb@evsabpcs骨移植材料的制备方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：
2.如权利要求1所述的鹿角-dcb@evsabpcs骨移植材料的制备方法，其特征在于，所述步骤1具体步骤为：
3.如权利要求2所述的鹿角-dcb@evsabpcs骨移植材料的制备方法，其特征在于，s1中超声波处理具体为：使用40khz超声波将骨样品处理20min。
4.如权利要求2所述的鹿角-dcb@evsabpcs骨移植材料的制备方法，其特征在于，s4中再次清洗具体为：使用流动水清洗骨样品3次，每次0.5小时，随后将骨样品浸泡在含有1mg/ml的dnase溶液中48小时，再次清洗后将样品浸泡在含有0.5mg/mlrnase的溶液中48小时，流动水清洗3次...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄景辉，邱强，李胜友，高楗勃，夏冰，杨雨洁，
申请(专利权)人：中国人民解放军空军军医大学，
类型：发明
国别省市：
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