【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于非天然碱基，具体涉及一种含m3t非天然碱基的体外转录方法及其评价分析方法。
技术介绍
1、在自然界中，生物体天然碱基构筑生命活动中的信息存储和表达体系，实现了生命形式的多样性。但是用于构筑生命的天然碱基仅有a、t/u、g、c，只能编码64种密码子，这限制了核酸分子的化学、结构和功能多样性，从而限制了核酸分子的生物学应用。非天然碱基技术是从源头设计、合成、评价和应用的技术体系，新型非天然碱基的发现可丰富核酸分子的化学和结构多样性、提高遗传信息的存储容量、扩展其生物和医学应用，目前已成为化学生物学一个新的前沿领域。
2、但是非天然碱基技术依然面对诸多的挑战。首先是具有优良复制和转录活性的非天然碱基结构多样性有限，目前仅有p/z、ds/px、tpt3/nam三类具有代表性的非天然碱基对，非天然碱基化学结构的局限性成为非天然碱基技术生物医学应用的瓶颈。因此，如何利用氢键位移、空间位阻、形状互补及疏水相互作用等原则设计、合成新型人工碱基对仍然是一项具有挑战性的任务。其次，不同类型非天然碱基的复制、转录、翻译效率和规律研究不足，缺乏有效的体内外遗传密码扩展体系。而有效的体内外遗传密码扩展体系是非天然碱基生物医学应用的关键技术，建立非天然碱基基因扩展体系将有利于非天然碱基在基因诊断、功能性核酸分子开发和定点修饰、蛋白药物改造、防疫、生物传感等领域的应用和发展。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种含m3t非天然碱基的体外转录方法，该体外转录方法采用t
2、本专利技术的另一目的在于提供一种针对上述体外转录方法获得的转录产物的评价分析方法，该评价分析方法能够简单、有效地评价含m3t非天然碱基的短链和中长链rna转录产物的保真度，为m3t核苷rna定点转录提供了详细的依据。
3、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：
4、本专利技术提供了一种含m3t非天然碱基的体外转录方法，所述体外转录方法包括含m3t非天然碱基的短链rna体外转录方法和含m3t非天然碱基的中长链rna体外转录方法；
5、所述含m3t非天然碱基的短链rna体外转录方法包括如下步骤：将含tpt3的非天然碱基转录模板与t7启动子混合反应，获得双链转录模板dna；利用t7 rna聚合酶催化上述双链转录模板dna进行体外转录反应，转录反应结束后，消解转录模板dna获得含m3t非天然碱基的短链rna转录产物；
6、所述含m3t非天然碱基的中长链rna体外转录方法包括如下步骤：利用pcr扩增获得含nam/tpt3非天然碱基对的双链转录模板dna；利用t7 rna聚合酶催化上述双链转录模板dna进行体外转录反应，转录反应结束后，消解转录模板dna获得含m3t非天然碱基的中长链rna转录产物。
7、优选地，所述体外转录反应的试剂包括transcription buffer、ntps、rnaseinhibitor、无机焦磷酸酶、无酶无菌水、rm3ttp。
8、优选地，所述体外转录反应的条件为35～37℃反应5～8小时。
9、优选地，所述体外转录方法还包括利用含8m尿素5％变性聚丙烯酰胺凝胶对所述短链rna转录产物或中长链rna转录产物进行检测。
10、本专利技术还提供了一种所述的体外转录方法获得的含m3t非天然碱基的rna转录产物。
11、本专利技术还提供了一种所述的含m3t非天然碱基的rna转录产物的评价分析方法，所述评价分析方法包括含m3t非天然碱基的短链rna转录产物的保真度评价方法和含m3t非天然碱基的中长链rna转录产物的保真度评价方法。
12、优选地，所述含m3t非天然碱基的短链rna转录产物的保真度评价方法包括如下步骤：对获得的短链rna转录产物进行纯化，采用核酸消化酶将纯化后的短链rna转录产物消解为单核苷；利用高效液相色谱法对消解产物进行检测，采用单点摩尔浓度校正法对a、t/u、g、c、m3t核苷检测峰峰面积进行校正，通过各核苷峰面积比例计算转录产物核苷组成；以m3t实际检测比例与理论比例的比值计算m3t核苷的转录产物的保真度。
13、优选地，所述含m3t非天然碱基的中长链rna转录产物的保真度评价方法包括如下步骤：对获得的中长链rna转录产物进行纯化，利用反转录酶对纯化后的中长链rna转录产物进行反转录获得反转录pcr产物，将反转录pcr产物进行sanger测序，利用tpt3在sanger测序中测序原始信号突然终止的特征判断m3t非天然碱基中长链rna转录产物的保真度。
14、优选地，所述评价分析方法还包括对含m3t非天然碱基体外转录序列的普适性分析。
15、本专利技术与现有技术相比，具有以下有益效果：
16、(1)本专利技术利用tpt3、nam和m3t非天然碱基系统实现了中长链rna中m3t定点转录和修饰。即利用nam-tpt3碱基对的高保真复制特性和pcr扩增兼容性扩增获得含tpt3的双链dna转录模板，再基于m3t-tpt3碱基对，在t7 rna聚合酶催化下将m3t引入到中长链rna中特定位点。此外，本专利技术验证发现市售商业化反转录酶包括反转录酶xl和反转录酶m均可识别dtpt3tp催化其与rna中m3t配对，生成在特点位点含tpt3的cdna。本专利技术利用m3t-tpt3的这一特性，针对中长链rna中的m3t建立了基于反转录的测序分析方法，将rna中的m3t碱基转化为cdna中的tpt3，进而在cdna的pcr扩增中转化为双链dna中的tpt3-nam碱基对，利用tpt3-nam碱基对在sanger测序中的测序原始信号突然终止的特征即可判断中长链rna中m3t碱基转录保真度，通过对sanger测序结果的分析提示m3t碱基可以实现中长链rna的高保真转录。
17、(2)本专利技术还通过序列普适性分析发现，m3t核苷转录具有序列普适性，在上下游三个随机序列环境下读取获得了所有4096种可能的序列组合。通过对非天然碱基位点上下游核苷组合进行分析，发现了最具转录优势的5’-nnnxtan-3’序列组合形式，同时发现了对转录效率可能产生影响的5’-ggnxnnn-3’序列组合形式。以上结果有利于指导m3t核苷rna定点转录和修饰时设计转录效率更高的模板序列，或者评价特定序列环境下转录的可行性，为m3t核苷rna定点转录提供了详细的依据。
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1.一种含m3T非天然碱基的体外转录方法，其特征在于，所述含m3T非天然碱基的体外转录方法包括含m3T非天然碱基的短链RNA体外转录方法和含m3T非天然碱基的中长链RNA体外转录方法；
2.根据权利要求1所述的体外转录方法，其特征在于，所述体外转录的反应试剂包括Transcription Buffer、NTPs、RNase inhibitor、无机焦磷酸酶、无酶无菌水、rm3TTP。
3.根据权利要求1所述的体外转录方法，其特征在于，所述体外转录反应的条件为35～37℃反应5～8小时。
4.根据权利要求1所述的体外转录方法，其特征在于，所述体外转录方法还包括利用含8M尿素5％变性聚丙烯酰胺凝胶对所述短链RNA转录产物或中长链RNA转录产物进行检测。
5.权利要求1～4任意一项所述的体外转录方法获得的含m3T非天然碱基的RNA转录产物。
6.一种权利要求5所述的含m3T非天然碱基的RNA转录产物的评价分析方法，其特征在于，所述评价分析方法包括对含m3T非天然碱基转录产物的保真度评价方法和含m3T非天然碱基的中长链RNA转录
7.根据权利要求6所述的评价分析方法，其特征在于，所述含m3T非天然碱基的短链RNA转录产物的保真度评价方法包括如下步骤：对获得的短链RNA转录产物进行纯化，采用核酸消化酶将纯化后的短链RNA转录产物消解为单核苷；利用高效液相色谱法对消解产物进行检测，采用单点摩尔浓度校正法对A、T/U、G、C、m3T核苷检测峰峰面积进行校正，通过各核苷峰面积比例计算转录产物核苷组成；以m3T实际检测比例与理论比例的比值计算m3T核苷的转录产物的保真度。
8.根据权利要求6所述的评价分析方法，其特征在于，所述含m3T非天然碱基的中长链RNA转录产物的保真度评价方法包括如下步骤：对获得的中长链RNA转录产物进行纯化，利用反转录酶对纯化后的中长链RNA转录产物进行反转录获得反转录PCR产物，将反转录PCR产物进行Sanger测序，利用TPT3在Sanger测序中测序原始信号突然终止的特征判断m3T非天然碱基中长链RNA转录产物的保真度。
9.根据权利要求6所述的评价分析方法，其特征在于，所述评价分析方法还包括对含m3T非天然碱基体外转录序列的普适性分析。
...【技术特征摘要】
1.一种含m3t非天然碱基的体外转录方法，其特征在于，所述含m3t非天然碱基的体外转录方法包括含m3t非天然碱基的短链rna体外转录方法和含m3t非天然碱基的中长链rna体外转录方法；
2.根据权利要求1所述的体外转录方法，其特征在于，所述体外转录的反应试剂包括transcription buffer、ntps、rnase inhibitor、无机焦磷酸酶、无酶无菌水、rm3ttp。
3.根据权利要求1所述的体外转录方法，其特征在于，所述体外转录反应的条件为35～37℃反应5～8小时。
4.根据权利要求1所述的体外转录方法，其特征在于，所述体外转录方法还包括利用含8m尿素5％变性聚丙烯酰胺凝胶对所述短链rna转录产物或中长链rna转录产物进行检测。
5.权利要求1～4任意一项所述的体外转录方法获得的含m3t非天然碱基的rna转录产物。
6.一种权利要求5所述的含m3t非天然碱基的rna转录产物的评价分析方法，其特征在于，所述评价分析方法包括对含m3t非天然碱基转录产物的保真度评价方法和含m3t非天然碱基的中长链rna转录产物的...
【专利技术属性】
技术研发人员：李凌君，朱吾元，尚林春，王红磊，朱安莲，
申请(专利权)人：河南师范大学，
类型：发明
国别省市：
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