【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，涉及表观遗传调控，具体地，涉及用于检测lsd1蛋白结合位点的融合多核苷酸、试剂盒和方法。
技术介绍
1、表观遗传学是指研究生物除了dna序列以外的可遗传信息。自从生物学中发现dna序列作为遗传密码以来，人们发现除了一些非核酸序列的改变诸如dna甲基化、组蛋白修饰也可以保存并传递给后代。
2、在真核细胞的细胞核中，dna处于被染色质包裹的状态。由组蛋白八聚体组成的核小体是染色质的基本结构，核小体包含中心的h3-h4四聚体和两个侧面的h2a-h2b二聚体，共被146个dna碱基对环绕(jenuwein t，allis c d.translating the histone code[j].science(new york，ny)，2001，293(5532)：1074-80)。四种核小体组蛋白(h2a、h2b、h3、h4)在细胞核内与染色体相关的生命活动中被广泛利用，它们可以有多种化学修饰，包括组蛋白甲基化、乙酰化、磷酸化和泛素化等。组蛋白甲基化通过将赖氨酸残基单甲基化、二甲基化和三甲基化的方式激活或抑制基因表达，主要发生在组蛋白h3和h4的精氨酸(r)和赖氨酸(k)残基上，是最重要的表观遗传修饰之一。组蛋白甲基化系统由添加标记的组蛋白甲基转移酶(writers)和去除标记的组蛋白去甲基化酶(erasers)动态调节，与组蛋白修饰结合的效应蛋白(readers)则将这些动态调节信号转化为功能结果(jenuwein t，allis cd.translating the histone code[j].s
3、组蛋白去甲基化酶是具有去除组蛋白甲基化修饰能力的一类酶，其中包括赖氨酸特异性去甲基化酶1(lsd1)以及jmjc家族去甲基化酶。研究表明，在体外，lsd1对单甲基化和二甲基化h3k4具有高度特异性，可特异地去除甲基化修饰，而在体内则可以去除h3k9的单甲基化和二甲基化修饰(shiy，lan f，matson c，et al.histone demethylationmediated by the nuclear amine oxidase homolog lsd1[j].cell，2004，119(7)∶941-53)。
4、由于lsd1与染色质的结合具有动态性以及与基因组结合能力较弱，可能导致不同时间点之间存在较大差异，导致chip-seq技术只能够分析出部分结合位点，覆盖面不全，并且重复性差。
技术实现思路
1、基于此，本专利技术的目的是提供一种用于检测lsd1蛋白结合位点(lsd1蛋白与dna的结合位点)的融合多核苷酸、试剂盒和方法，通过本专利技术所述检测方法可以获得重复性好，准确性高，覆盖面更全的lsd1蛋白结合位点数据。
2、本专利技术的第一个方面，是提供一种用于检测lsd1蛋白结合位点的融合多核苷酸，所述融合多核苷酸包括lsd1蛋白编码核苷酸和位于其下游的turboid蛋白编码核苷酸，两者通过连接序列相连；所述连接序列的核苷酸序列如seq id no：1所示。
3、在其中一些实施例中，所述lsd1蛋白编码核苷酸序列如seq id no：2所示。
4、在其中一些实施例中，所述turboid蛋白编码核苷酸序列如seq id no：3所示。
5、本专利技术的第二个方面，是提供一种重组表达载体，所述重组表达载体含有如上所述的融合多核苷酸。
6、在其中一些实施例中，所述重组表达载体的骨架为慢病毒载体。
7、本专利技术的第三个方面，是提供一种检测lsd1蛋白结合位点的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的融合多核苷酸或如上所述的重组表达载体。
8、在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括用于沉默lsd1基因的sgrna；优选地，所述sgrna核苷酸序列如seq id no：5所示。
9、在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括生物素和/或生物素抗体。
10、本专利技术的第四个方面，是提供一种检测lsd1蛋白结合位点的方法，使用如上所述的试剂盒进行检测，包括以下步骤：(1)构建lsd1基因敲除的细胞系；(2)将所述融合多核苷酸或重组表达载体导入所述细胞系中，获得重组表达细胞系；(3)培养所述重组表达细胞系，构建文库，测序。
11、在其中一些实施例中，所述构建文库包括利用生物素抗体和采用cut&tag技术。
12、在其中一些实施例中，使用crispr-cas9技术构建lsd1基因敲除的细胞系。
13、在其中一些实施例中，培养所述重组表达细胞系并加入生物素处理。
14、在其中一些实施例中，所述生物素在所述重组表达细胞系培养体系中的终浓度为250μm～500μm。
15、在其中一些实施例中，所述生物素的处理时间为10h～15h。
16、本专利技术建立了检测lsd1蛋白结合位点的方法和试剂盒，创造性地利用crispr-cas9技术，敲除细胞系内lsd1基因，将turboid编码基因插入到lsd1基因后方，在细胞培养过程中利用生物素(biotin)处理turboid阳性的细胞，使用biotin抗体开展靶向biotin的cut&tag实验，以获得重复性较好，覆盖面更全的表观基因组数据。并且，在该方法中，构建到适合检测的融合多核苷酸，所述融合多核苷酸包含lsd1蛋白编码核苷酸和turboid蛋白编码核苷酸，两者之间通过合适核苷酸组成的连接序列相连接，所述融合多核苷酸可翻译形成lsd1-turboid融合蛋白。所述连接序列针对lsd1蛋白和turboid蛋白的编码核苷酸序列进行了优化，可提高所述融合多核苷酸转录的高效性和准确性，保证lsd1-turboid融合蛋白可以高效、准确地表达，避免因翻译效率低或翻译偏差影响后续对lsd1蛋白结合位点的检测，从而提高检测结果的全面性和准确性。
17、本专利技术检测lsd1蛋白结合位点的方法重复性较好，准确性高，可覆盖面更全的表观基因组数据，可以有效揭示lsd1的调控位点和下游靶标基因，推动表观遗传的相关研究。
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1.一种用于检测LSD1蛋白结合位点的融合多核苷酸，其特征在于，所述融合多核苷酸包括LSD1蛋白编码核苷酸和位于其下游的TurboID蛋白编码核苷酸，两者通过连接序列相连；所述连接序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.如权利要求1所述的融合多核苷酸，其特征在于，所述LSD1蛋白编码核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.如权利要求1所述的融合多核苷酸，其特征在于，所述TurboID蛋白编码核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体含有如权利要求1～3任一项所述的融合多核苷酸。
5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体的骨架为慢病毒载体。
6.一种检测LSD1蛋白结合位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1～3任一项所述的融合多核苷酸或如权利要求4～5任一项所述的重组表达载体。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于沉默LSD1基因的sgRNA；优选地，所述sgRNA核苷酸序列如SE
8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括生物素和/或生物素抗体。
9.一种检测LSD1蛋白结合位点的方法，其特征在于，使用如权利要求6N8任一项所述的试剂盒进行检测，包括以下步骤：(1)构建LSD1基因敲除的细胞系；(2)将权利要求1N3任一项所述的所述融合多核苷酸或权利要求4～5任一项所述的重组表达载体导入所述细胞系中，获得重组表达细胞系；
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，培养所述重组表达细胞系并加入生物素处理；优选地，所述生物素在所述重组表达细胞系培养体系中的终浓度为250μM～500μM；和/或，
...【技术特征摘要】
1.一种用于检测lsd1蛋白结合位点的融合多核苷酸，其特征在于，所述融合多核苷酸包括lsd1蛋白编码核苷酸和位于其下游的turboid蛋白编码核苷酸，两者通过连接序列相连；所述连接序列的核苷酸序列如seq id no：1所示。
2.如权利要求1所述的融合多核苷酸，其特征在于，所述lsd1蛋白编码核苷酸序列如seq id no：2所示。
3.如权利要求1所述的融合多核苷酸，其特征在于，所述turboid蛋白编码核苷酸序列如seq id no：3所示。
4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体含有如权利要求1～3任一项所述的融合多核苷酸。
5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体的骨架为慢病毒载体。
6.一种检测lsd1蛋白结合位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1～3任一项所述的融合多核苷...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙昊，刘正言，刘琳，郑辉，
申请(专利权)人：中国科学院广州生物医药与健康研究院，
类型：发明
国别省市：
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