【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，尤其涉及一种用于制备环状rna的构建体、试剂盒、制备方法和环状rna及应用。
技术介绍
1、环状rna(circrna)是一类单链闭合呈环状的rna分子，在内部核糖体进入位点(ires)的协助下，其能够翻译表达任意目标蛋白，可以作为候选疫苗或药物进行开发。
2、circrna的富集程度是体外合成法制备高纯度circrna的重要影响因素，目前主要采用rnase r消化未环化的线性rna，以实现对circrna的富集。但是，由于线性rna其内部的碱基互补配对会形成复杂的二级结构，导致rnase r消化效率低，需要使用高浓度的rnaser，而rnase r因价格昂贵，且circrna并不完全抵抗rnase r，高浓度的rnase r也会导致circrna的降解，无法很好地实现circrna的低成本大规模富集，具有较大的局限性。
3、因此，获得一种高效、经济的circrna富集方法，并将其应用于circrna的工业规模富集，以促进mrna药物和疫苗的研究与应用，具有重要意义。
技术实现思路
1、本专利技术的第一目的在于提供一种用于制备环状rna的构建体，该构建体中包括有富腺嘌呤的标记序列，且该标记序列的长度为20～120nt，该标记序列的引入能够优化所述构建体的空间结构，提高其所具有的自我剪切催化活性，从而促进该构建体在体外转录中的成环过程，有效地提高了成环效率；同时，可通过对标记序列在构建体上位置的选择，以使得最终环状rna中保留或不保留该标记
2、本专利技术的第二目的在于提供环状rna的制备方法。
3、本专利技术的第三目的在于提供一种制备环状rna的试剂盒。
4、本专利技术的第四目的在于提供一种环状rna。
5、本专利技术的第五目的在于提供上述构建体、试剂盒和/或环状rna在制备mrna产品中的应用。
6、具体的，本专利技术提供的制备环状rna的构建体沿着5’至3’的方向依次包括：3’-内含子、有或无外显子2、ires序列、目的基因、有或无外显子1和5’-内含子，且所述构建体包括标记序列，所述标记序列的长度为20～120nt，所述标记序列中腺嘌呤或其互补碱基的含量为50～100％。
7、进一步的，所述标记序列位于ires序列的5’端和/或目的基因的3’端，通过所述构建体制备得到的环状rna中保留有标记序列。
8、进一步的，所述构建体沿着5’至3’的方向包括依次连接的3’-内含子、有或无外显子2、标记序列、ires序列、目的基因、有或无外显子1和5’-内含子。
9、进一步的，所述构建体沿着5’至3’的方向包括依次连接的3’-内含子、有或无外显子2、ires序列、目的基因、标记序列、有或无外显子1和5’-内含子。
10、进一步的，所述构建体沿着5’至3’的方向包括依次连接的3’-内含子、有或无外显子2、标记序列、ires序列、目的基因、标记序列、有或无外显子1和5’-内含子。
11、进一步的，所述标记序列位于3’-内含子的5’端、5’-内含子的3’端、3’-内含子的内部和/或5’-内含子的内部，通过所述构建体制备得到的环状rna中不保留有标记序列。
12、进一步的，所述构建体沿着5’至3’的方向包括依次连接的标记序列、3’-内含子、有或无外显子2、ires序列、目的基因、有或无外显子1和5’-内含子。
13、进一步地，所述构建体沿着5’至3’的方向包括依次连接的标记序列、3’-内含子、有或无外显子2、ires序列、目的基因、有或无外显子1和5’-内含子，且所述3’-内含子和/或5’-内含子中还插入有标记序列。
14、进一步的，所述构建体沿着5’至3’的方向包括依次连接的3’-内含子、有或无外显子2、ires序列、目的基因、有或无外显子1、5’-内含子和标记序列。
15、进一步地，所述构建体沿着5’至3’的方向包括依次连接的3’-内含子、有或无外显子2、ires序列、目的基因、有或无外显子1、5’-内含子和标记序列，且所述3’-内含子和/或5’-内含子中还插入有标记序列。
16、进一步的，所述构建体沿着5’至3’的方向包括依次连接的标记序列、3’-内含子、有或无外显子2、ires序列、目的基因、有或无外显子1、5’-内含子和标记序列。
17、进一步地，所述构建体沿着5’至3’的方向包括依次连接的3’-内含子、标记序列、有或无外显子2、ires序列、目的基因、有或无外显子1、5’-内含子和标记序列，且所述3’-内含子和/或5’-内含子中还插入有标记序列。
18、进一步地，所述构建体沿着5’至3’的方向包括依次连接的3’-内含子、有或无外显子2、ires序列、目的基因、有或无外显子1和5’-内含子，且所述3’-内含子和/或5’-内含子中插入有标记序列。
19、进一步的，所述构建体衍生自铜绿微囊藻i型内含子、尖孢镰刀菌cob基因的i型内含子和鱼腥藻(anabaena)trna的i型内含子中的一种或多种。
20、进一步的，所述3’-内含子的核苷酸序列如seq id no:2所示，外显子2的核苷酸序列如seq id no:3所示，外显子1的核苷酸序列如seq id no:7所示，所述5’-内含子的核苷酸序列如seq id no:8所示。
21、进一步地，所述3’-内含子的核苷酸序列如seq id no:12所示，5’-内含子的核苷酸序列如seq id no:13所示。
22、进一步地，所述3’-内含子的核苷酸序列如seq id no:14所示，外显子2的核苷酸序列如seq id no:15所示，外显子1的核苷酸序列如seq id no:16所示，所述5’-内含子的核苷酸序列如seq id no:17所示。
23、进一步的，所述ires序列选自柯萨奇病毒ires序列、脑心肌炎病毒ires序列、脊髓灰质炎病毒ires序列、卡波西肉瘤病毒ires序列和疱疹病毒液ires序列中的一种或多种。
24、进一步的，所述ires序列的核苷酸序列如seq id no:5所示。
25、本专利技术提供的环状rna的制备方法包括：取上述构建体进行体外转录，得到体外转录产物；取所述体外转录产物进行oligo(dw)富集处理，得到所述环状rna。
26、进一步的，所述oligo(dw)富集处理的方法选自oligo(dt)富集处理和/或oligo(da)富集处理。
27、本专利技术提供的制备环状rna的试剂盒包括上述构建体和oligo(dw)固定剂。
28、本专利技术提供的环状rna是通过上述环状rna的制备方法制备得到的。
29、本专利技术还提供了上述构建体、试剂盒和/或环状rna在制本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于制备环状RNA的构建体，所述构建体沿着5’至3’的方向依次包括：3’-内含子、有或无外显子2、IRES序列、目的基因、有或无外显子1和5’-内含子，其特征在于，所述构建体包括标记序列，所述标记序列的长度为20～120nt，所述标记序列中腺嘌呤或其互补碱基的含量为50～100％。
2.根据权利要求1所述的用于制备环状RNA的构建体，其特征在于，所述标记序列位于IRES序列的5’端和/或目的基因的3’端，通过所述构建体制备得到的环状RNA中保留有标记序列。
3.根据权利要求2所述的用于制备环状RNA的构建体，其特征在于，所述构建体沿着5’至3’的方向包括依次连接的3’-内含子、有或无外显子2、标记序列、IRES序列、目的基因、有或无外显子1和5’-内含子；
4.根据权利要求1所述的用于制备环状RNA的构建体，其特征在于，所述标记序列位于3’-内含子的5’端、5’-内含子的3’端、3’-内含子的内部和/或5’-内含子的内部，通过所述构建体制备得到的环状RNA中不保留有标记序列。
5.根据权利要求4所述的用于制备环状RNA的构建
6.根据权利要求1所述的用于制备环状RNA的构建体，其特征在于，所述构建体衍生自铜绿微囊藻I型内含子、尖孢镰刀菌cob基因的I型内含子和鱼腥藻(Anabaena)tRNA的I型内含子中的一种或多种；
7.根据权利要求1所述的用于制备环状RNA的构建体，其特征在于，所述IRES序列选自柯萨奇病毒IRES序列、脑心肌炎病毒IRES序列、脊髓灰质炎病毒IRES序列、卡波西肉瘤病毒IRES序列和疱疹病毒IRES序列中的一种或多种；
8.一种环状RNA的制备方法，其特征在于，该制备方法包括：取权利要求1～7任一所述的构建体进行体外转录，得到体外转录产物；
9.根据权利要求8所述的环状RNA的制备方法，其特征在于，所述oligo(dW)富集处理的方法选自oligo(dT)富集处理和/或oligo(dA)富集处理。
10.一种制备环状RNA的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括权利要求1～7任一所述的构建体和oligo(dW)固定剂。
11.一种环状RNA，其特征在于，该环状RNA通过权利要求8或9所述的环状RNA的制备方法制备得到。
12.权利要求1～7任一所述的构建体、权利要求10所述的试剂盒和/或权利要求11所述的环状RNA在制备RNA产品中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种用于制备环状rna的构建体，所述构建体沿着5’至3’的方向依次包括：3’-内含子、有或无外显子2、ires序列、目的基因、有或无外显子1和5’-内含子，其特征在于，所述构建体包括标记序列，所述标记序列的长度为20～120nt，所述标记序列中腺嘌呤或其互补碱基的含量为50～100％。
2.根据权利要求1所述的用于制备环状rna的构建体，其特征在于，所述标记序列位于ires序列的5’端和/或目的基因的3’端，通过所述构建体制备得到的环状rna中保留有标记序列。
3.根据权利要求2所述的用于制备环状rna的构建体，其特征在于，所述构建体沿着5’至3’的方向包括依次连接的3’-内含子、有或无外显子2、标记序列、ires序列、目的基因、有或无外显子1和5’-内含子；
4.根据权利要求1所述的用于制备环状rna的构建体，其特征在于，所述标记序列位于3’-内含子的5’端、5’-内含子的3’端、3’-内含子的内部和/或5’-内含子的内部，通过所述构建体制备得到的环状rna中不保留有标记序列。
5.根据权利要求4所述的用于制备环状rna的构建体，其特征在于，所述构建体沿着5’至3’的方向包括依次连接的标记序列、3’-内含子、有或无外显子2、ires序列、目的基因、有或无外显子1和5’-内含...
【专利技术属性】
技术研发人员：汪大明，李惠，薛永博，张莉莉，杨鹏，方涵，郭晴，
申请(专利权)人：毕昇北京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。