【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及对枯草芽孢杆菌来源的壳聚糖酶的底物通道的关键位点突变获得产壳四糖的突变体，属于酶工程。
技术介绍
1、壳聚糖酶（ec3.2.1.132）是一种糖苷水解酶，通过水解壳聚糖中的β-1,4-糖苷键，产生具有不同聚合度（dp）的壳寡糖（cos）。cos具有良好的生物安全性，水溶性，不致敏性，有研究报道表明cos具有抗肿瘤，抗癌，降低血脂，提高免疫力，抗氧化作用，在农业上具有抗菌抗虫，抗病毒作用，因此，在食品和农业中有多种应用潜力。根据氨基酸序列的相似性，壳聚糖酶主要来源于七个糖苷水解酶家族，即gh3、gh5、gh7、gh8、gh46、gh75和gh80。根据不同的裂解单元结构，壳聚糖酶也可被划分为四种类型，classⅰ家族，classⅱ家族，classⅲ家族，classⅳ家族。
2、壳聚糖（chitosan, cs）是经甲壳素脱乙酰酶（chitin deacetylase）催化甲壳素中的乙酰基得到的脱乙酰产物。壳寡糖（chitosan oligosaccharide，cos）可直接由壳聚糖水解或甲壳素（chitin）经脱乙酰化、水解而成。有研究指出高聚合度的壳寡糖的生物活性更好。因此获得高聚合度cos跟具有实际应用价值。
3、壳寡糖的制备有化学法，物理法和生物酶法。化学法反应剧烈，会产生污染，不环保，物理法产率低，酶法与其他两种方法相比具有反应条件温和、可控性、产率高、重现性好和对环境有益等优点。所以目前生物酶法是研究热点，通过对酶的分子改造，旨在获得高效催化壳聚糖产高聚合度壳寡糖的壳聚糖酶。>
技术实现思路
1、本专利技术对枯草芽孢杆菌( bacillus subtilis)壳聚糖酶bscsn46a的底物通道进行分析，发现可能会影响水解产物聚合度的位点，将关键位点进行突变，筛选出具有产壳四糖潜力的突变体。
2、专利技术人前期研究发现将枯草芽孢杆菌壳聚糖酶bscsn46a的第50位苏氨酸突变成酸性氨基酸e（谷氨酸）或碱性氨基酸k（赖氨酸），其中t50e水解壳聚糖除产生壳二糖和壳三糖外，还有壳四糖生成（cn116590260a）。而突变成大体积疏水侧链氨基酸w或小体积侧链氨基酸a，均能水解壳聚糖产壳四糖（cn116656654a）。考虑到第50位苏氨酸突变可能与产物聚合物高度相关，本专利技术将枯草芽孢杆菌壳聚糖酶bscsn46a的的第50位进行饱和突变，并在大肠杆菌 e. coli bl21(de3)中表达，进一步筛选出具有产壳四糖潜力的突变体。
3、本专利技术的壳聚糖酶突变体，为枯草芽孢杆菌壳聚糖酶bscsn46a氨基酸序列第50位进行饱和突变，筛选出产壳四糖的突变体。将苏氨酸突变为缬氨酸，标记为t50v；将苏氨酸突变为甘氨酸，标记为t50g；将苏氨酸突变为络氨酸，标记为t50y；将苏氨酸突变为亮氨酸，标记为t50l；将苏氨酸突变为苯丙氨酸，标记为t50f；将苏氨酸突变为丝氨酸，标记为t50s；将苏氨酸突变为异亮氨酸，标记为t50i；将苏氨酸突变为精氨酸，标记为t50r；将苏氨酸突变为半胱氨酸，标记为t50c；将苏氨酸突变为天冬氨酸，标记为t50d；将苏氨酸突变为脯氨酸，标记为t50p；将苏氨酸突变为谷氨酰胺，标记为t50q；将苏氨酸突变为组氨酸，标记为t50h；将苏氨酸突变为天冬酰胺，标记为t50n。枯草芽孢杆菌壳聚糖酶bscsn46a氨基酸序列为seq id no:1，核苷酸序列seq id no:2；所述壳聚糖酶突变体t50v氨基酸序列为seq idno:3，核苷酸序列为seq id no:4；壳聚糖酶突变体t50g氨基酸序列为seq id no:5，核苷酸序列为seq id no:6；壳聚糖酶突变体t50y氨基酸序列为seq id no:7，核苷酸序列为seqid no:8；壳聚糖酶突变体t50l氨基酸序列为seq id no:9，核苷酸序列为seq id no:10；壳聚糖酶突变体t50f氨基酸序列为seq id no:11，核苷酸序列为seq id no:12；壳聚糖酶突变体t50s氨基酸序列为seq id no:13，核苷酸序列为seq id no:14；壳聚糖酶突变体t50i氨基酸序列为seq id no:15，核苷酸序列为seq id no:16；壳聚糖酶突变体t50r氨基酸序列为seq id no:17，核苷酸序列为seq id no:18；壳聚糖酶突变体t50c氨基酸序列为seqid no:19，核苷酸序列为seq id no:20；壳聚糖酶突变体t50d氨基酸序列为seq id no:21，核苷酸序列为seq id no:22；壳聚糖酶突变体t50p氨基酸序列为seq id no:23，核苷酸序列为seq id no:24；壳聚糖酶突变体t50q氨基酸序列为seq id no:25，核苷酸序列为seqid no:26；壳聚糖酶突变体t50h氨基酸序列为seq id no:27，核苷酸序列为seq id no:28；壳聚糖酶突变体t50n氨基酸序列为seq id no:29，核苷酸序列为seq id no:30。
4、本专利技术提供携带有上述编码壳聚糖酶突变体的基因的重组载体以及转化/转染重组载体的重组菌。
5、具体的突变步骤如下:
6、步骤1将基因序列seq id no：2克隆至质粒pet-28a中，构建重组质粒pet-bscsn46a；
7、两条引物分别为上游引物cgggatccgcgggactgaataaagatc，下游引物cccaagcttttaagggattacaaaattacc。
8、步骤2利用swiss-model在线软件对壳聚糖酶（bscsn46a）进行模拟，获得壳聚糖酶的空间结构。
9、步骤3通过底物通道模拟与分子对接找到与水解底物相关的关键位点（t50），进行饱和突变。
10、步骤4设计定点突变引物，通过pcr技术得到突变壳聚糖酶基因，将扩增的目的基因克隆到表达载体pet-28a中，构建重组质粒。
11、步骤5将步骤4的重组载体转入大肠杆菌 e. coli bl21（de3）进行诱导培养，离心后收集菌体，经超声破碎细胞后，使用ni-nta亲和层析柱进行蛋白纯化获得突变壳聚糖酶。
12、本专利技术提供的壳聚糖酶突变体在工业上的应用，具体的，除了生产壳二糖和壳三糖，还可以生产壳四糖。
13、在本专利技术的具体实施例中，将450 μl 1%胶体壳聚糖溶液、20 u纯化后的酶液、500μl ph6.6的磷酸盐缓冲液和9 μl 100 mm的mn2+构成水解体系，放置37 ℃，160 rpm摇床充分反应。tlc分析产四糖的突变酶的水解时间，发现突变体t50v，t50g在水解9 h后不产四糖；t50y，t50l在水解7 h后不产壳四糖；t50f，t50s，t50i，t50r,，t50c，t50d本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种产壳四糖的壳聚糖酶突变体，其特征在于，所述的壳聚糖酶突变体为以氨基酸取代枯草芽孢杆菌来源的壳聚糖酶BsCsn46A的如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第50位苏氨酸而得到；所述产壳四糖的壳聚糖酶突变体为以下任意一种：
2.编码权利要求1所述的产壳四糖的壳聚糖酶突变体的基因，其特征在于，编码T50V的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；编码T50G的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；编码T50Y的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；编码T50L的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；编码T50F的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；编码T50S的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示；编码T50I的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示；编码T50R的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示；编码T50C的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示；编码T50D的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示；编码T50P的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示；编码T50Q的核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示；编码T50H的
3.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求1所述的壳聚糖酶突变体或权利要求2所述的基因。
4.一种重组菌株，其特征在于，为包含权利要求1所述的壳聚糖酶突变体、或权利要求2所述的基因、或权利要求3所述的重组载体的宿主菌。
5.权利要求1所述的壳聚糖突变体的应用，其特征在于，所述壳聚糖酶突变体在催化水解壳聚糖产壳寡糖中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述壳聚糖酶突变体在催化壳聚糖的水解反应中生产壳四糖。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，水解反应体系中，底物的质量分数为0.45-0.5%，壳聚糖酶突变体用量为20U，反应温度为37℃。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，控制壳聚糖酶突变体在催化壳聚糖生产壳四糖的水解反应时间，其中，T50P、T50Q、T50H、T50N水解反应时间在3 h内，T50F、T50S、T50I、T50R,、T50C、T50D水解反应时间在5 h内，T50Y、T50L水解反应时间在7 h内，T50V、T50G水解时间在9 h内。
...【技术特征摘要】
1.一种产壳四糖的壳聚糖酶突变体，其特征在于，所述的壳聚糖酶突变体为以氨基酸取代枯草芽孢杆菌来源的壳聚糖酶bscsn46a的如seq id no:1所示的氨基酸序列的第50位苏氨酸而得到；所述产壳四糖的壳聚糖酶突变体为以下任意一种：
2.编码权利要求1所述的产壳四糖的壳聚糖酶突变体的基因，其特征在于，编码t50v的核苷酸序列如seq id no:4所示；编码t50g的核苷酸序列如seq id no:6所示；编码t50y的核苷酸序列如seq id no:8所示；编码t50l的核苷酸序列如seq id no:10所示；编码t50f的核苷酸序列如seq id no:12所示；编码t50s的核苷酸序列如seq id no:14所示；编码t50i的核苷酸序列如seq id no:16所示；编码t50r的核苷酸序列如seq id no:18所示；编码t50c的核苷酸序列如seq id no:20所示；编码t50d的核苷酸序列如seq id no:22所示；编码t50p的核苷酸序列如seq id no:24所示；编码t50q的核苷酸序列如seq id no:26所示；编码t50h的核苷酸序列如seq id no:28所...
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