【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及saa-小瓜虫感染检测，具体涉及saa-小瓜虫感染的早期预警因子检测方法。
技术介绍
1、瓦氏黄颡鱼又称江黄颡鱼，隶属鲇形目、鲿科、黄颡鱼属。瓦氏黄颡鱼主要生活在我国长江水系和与其相通的附属湖泊、河流中，作为长江土著鱼类，具有生长速度快、体型大、肉质鲜嫩、无肌间刺、肌肉脂肪含量高等优点，是重要的养殖经济鱼类。
2、小瓜虫病是鱼类常见的寄生虫性疾病，病原为多子小瓜虫。多子小瓜虫属膜口目、凹口科、小瓜虫属成员。该病发病时间主要集中在春、秋两季，在15-25℃时，病原增殖速度最快，皮肤和鳃是主要的发病部位。鱼类感染小瓜虫病后，出现厌食、反应迟钝、鱼体消瘦、发病部位遍布白点等情况。此病对瓦氏黄颡鱼等无鳞鱼以及鳞片不发达的鱼类危害尤为严重，且无针对小瓜虫病的特异性药物，一旦爆发，鱼群死亡率极高，被认为是鱼类的癌症。常规的显微镜检测难以区分养殖环境中的多子小瓜虫和纤毛虫，且病原数量少时不易检出。中华人民共和国国家标准《淡水鱼类小瓜虫病诊断规程》(gb/t3473-2017)规定了发病后多子小瓜虫的检测方法。曹泽艺,周庆杰,陈凯,等.多子小瓜虫pcr和sybr green实时荧光定量pcr检测方法的建立及应用[j].水产学报,2024,60:1-9.中使用多子小瓜虫线粒体coi序列成功构建了多子小瓜虫荧光定量检测方法，检测灵敏度为0.02个/μl。然而这些都是针对病原的检测方法，是否被感染仍需要进行鱼体检测。
3、血清淀粉样蛋白a(serumamyloida，saa)，是一种主要来自肝脏的敏感的急性时相反
4、为了给saa的功能分析和应用研究铺垫基础，且为了小瓜虫病的早预防、早控制，本专利技术提出一种saa-小瓜虫感染的早期预警因子检测方法。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供saa-小瓜虫感染的早期预警因子检测方法，为saa的功能分析和应用研究铺垫基础，且为小瓜虫病的早预防、早控制奠定基础。
2、为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：saa-小瓜虫感染的早期预警因子检测方法，具体步骤如下：
3、s1、提取rna；
4、s2、基因组dna去除与cdna的反转录；
5、s3、saa cds区的克隆载体构建：
6、s3.1、pcr扩增：以s2中反转录的cdna为模板，以瓦-saa-f/r为引物，配置pcr体系并扩增；
7、s3.2、连接：按照s3.1中pcr方法扩增saa，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳、胶回收后用于克隆载体构建；
8、s3.3、连接产物转化入dh5α中；
9、s4、构建saa系统发育树，分析saa在同物种间及不同物种间的进化关系；
10、s5、构建saa荧光定量检测引物设计与标准曲线；
11、s6、多子小瓜虫感染瓦氏黄颡鱼后saa表达；
12、s7、数据统计与分析。
13、优选的，s1中，采集健康瓦氏黄颡鱼及创伤瓦氏黄颡鱼的心、肝、脾、肾组织样本，样本匀浆处理后，提取rna，测量rna浓度；样本采集的具体步骤为：用洁净的刀片在鱼体侧面划0.5cm的伤口，4-5h后，采集样本于ep管中。
14、优选的，s2的具体步骤为：参照cdna反转录试剂盒，配置去残留基因组dna反应体系，置于pcr仪中孵育，反应液继续用于下一步反转录反应体系配置，继而进行反转录反应程序，反应完成后置于-20℃短期保存。
15、优选的，s3.1中，扩增完成后进行1％琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统观察pcr结果，并将产物进行序列测定。
16、优选的，s3.3具体步骤为：saa连接液缓慢加入至dh5α，轻柔混匀后，置于冰上30min，转入42℃热激90s，冰浴5min后，加入lb肉汤，37℃培养2h，2h后，将转化液4000r/min离心2min，弃去上清液，剩余料混匀后均匀铺在amp培养基上，37℃培养过夜，次日，挑取菌落进行菌落pcr鉴定与扩培，pcr鉴定为阳性的菌株进行测序，序列经ncbi比对无误后，10％甘油保菌备用。
17、优选的，s3.3中，测序结果经ncbi blast、editseq、dnaman去除载体序列后，上传ncbi申请序列号，并在ncbi上下载其他鱼类或哺乳动物的saa cds区序列利用dnaman和ai软件构建系统发育树，以分析saa在同物种间及不同物种间的进化关系。
18、优选的，s5的具体步骤为：根据s3.3中测序结果，选取100-200bp长度序列，使用primer premier5.0设计saa荧光定量检测上、下游引物q-瓦-saa-f/r；将s2中提取的cdna按照10-1、10-2、10-3、10-4、10-5五个浓度梯度进行10倍比的稀释，参照perfect startgreen qpcr supermix染料法荧光定量预混试剂说明书，配置荧光定量引物效价评定反应体系，按照两步法给定程序及温度对saa进行扩增，形成以cq值为纵坐标，稀释浓度为横坐标的标准曲线，分析其标准曲线的斜率、扩增效率和r2值；同时对反应结果趋势线起伏程度、线条分布、峰图大小、峰顶位置、cq值大小进行分析，判断在同一个引物扩增出单一重叠峰时，该反应条件下的引物是否有效，如若为否，则应进行反应条件优化或重新设计引物。
19、优选的，s6中，以不同感染时间的瓦氏黄颡鱼各组织cdna为模板，目标基因以q-瓦-saa-f/r为引物，内参基因以β-actin-f/r为引物，参照perfectstart green qpcrsupermix染料法荧光定量预混试剂盒配置pcr检测反应体系和反应程序，每个基因的每个样设置3个平行对照组，另每个组织设置3个阴性对照组和3个阳性对照组，一个组织共96个样本。
20、优选的，s7中，以感染时间为横轴，相同组织的不同样本为纵轴，分别计算saa和β-actin每个平行对照组的平均值，以β-actin每个平行对照组的平均值为ref，saacq平均值减去ref得到δcq，利用prism软件本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.SAA-小瓜虫感染的早期预警因子检测方法，其特征在于，具体步骤如下：
2.根据权利要求1所述的SAA-小瓜虫感染的早期预警因子检测方法，其特征在于，S1中，采集健康瓦氏黄颡鱼及创伤瓦氏黄颡鱼的心、肝、脾、肾组织样本，样本匀浆处理后，提取RNA，测量RNA浓度；
3.根据权利要求1所述的SAA-小瓜虫感染的早期预警因子检测方法，其特征在于，S2的具体步骤为：参照cDNA反转录试剂盒，配置去残留基因组DNA反应体系，置于PCR仪中孵育，反应液继续用于下一步反转录反应体系配置，继而进行反转录反应程序，反应完成后置于-20℃短期保存。
4.根据权利要求1所述的SAA-小瓜虫感染的早期预警因子检测方法，其特征在于，S3.1中，扩增完成后进行1％琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统观察PCR结果，并将产物进行序列测定。
5.根据权利要求1所述的SAA-小瓜虫感染的早期预警因子检测方法，其特征在于，S3.3具体步骤为：saa连接液缓慢加入至DH5α，轻柔混匀后，置于冰上30min，转入42℃热激90s，冰浴5min后，加入LB肉汤，37℃培养2h，
6.根据权利要求1所述的SAA-小瓜虫感染的早期预警因子检测方法，其特征在于，S3.3中，测序结果经NCBI BLAST、EditSeq、DNAMAN去除载体序列后，上传NCBI申请序列号，并在NCBI上下载其他鱼类或哺乳动物的saa CDS区序列利用DNAMAN和AI软件构建系统发育树，以分析saa在同物种间及不同物种间的进化关系。
7.根据权利要求1所述的SAA-小瓜虫感染的早期预警因子检测方法，其特征在于，S5的具体步骤为：根据S3.3中测序结果，选取100-200bp长度序列，使用Primer Premier5.0设计saa荧光定量检测上、下游引物q-瓦-saa-F/R；
8.根据权利要求1所述的SAA-小瓜虫感染的早期预警因子检测方法，其特征在于，S6中，以不同感染时间的瓦氏黄颡鱼各组织cDNA为模板，目标基因以q-瓦-saa-F/R为引物，内参基因以β-actin-F/R为引物，参照PerfectStart Green qPCR SuperMix染料法荧光定量预混试剂盒配置PCR检测反应体系和反应程序，每个基因的每个样设置3个平行对照组，另每个组织设置3个阴性对照组和3个阳性对照组，一个组织共96个样本。
9.根据权利要求1所述的SAA-小瓜虫感染的早期预警因子检测方法，其特征在于，S7中，以感染时间为横轴，相同组织的不同样本为纵轴，分别计算saa和β-actin每个平行对照组的平均值，以β-actin每个平行对照组的平均值为Ref，saaCq平均值减去Ref得到ΔCq，利用prism软件one-way-anova差异分析程序对ΔCq进行数据处理，通过邓尼特的多重比较检验方法分别得到同一组织间多子小瓜虫感染瓦氏黄颡鱼后，0d与5d、10d、20d、40d和濒死间的显著性差异以及P值大小；
...【技术特征摘要】
1.saa-小瓜虫感染的早期预警因子检测方法，其特征在于，具体步骤如下：
2.根据权利要求1所述的saa-小瓜虫感染的早期预警因子检测方法，其特征在于，s1中，采集健康瓦氏黄颡鱼及创伤瓦氏黄颡鱼的心、肝、脾、肾组织样本，样本匀浆处理后，提取rna，测量rna浓度；
3.根据权利要求1所述的saa-小瓜虫感染的早期预警因子检测方法，其特征在于，s2的具体步骤为：参照cdna反转录试剂盒，配置去残留基因组dna反应体系，置于pcr仪中孵育，反应液继续用于下一步反转录反应体系配置，继而进行反转录反应程序，反应完成后置于-20℃短期保存。
4.根据权利要求1所述的saa-小瓜虫感染的早期预警因子检测方法，其特征在于，s3.1中，扩增完成后进行1％琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统观察pcr结果，并将产物进行序列测定。
5.根据权利要求1所述的saa-小瓜虫感染的早期预警因子检测方法，其特征在于，s3.3具体步骤为：saa连接液缓慢加入至dh5α，轻柔混匀后，置于冰上30min，转入42℃热激90s，冰浴5min后，加入lb肉汤，37℃培养2h，2h后，将转化液4000r/min离心2min，弃去上清液，剩余料混匀后均匀铺在amp培养基上，37℃培养过夜，次日，挑取菌落进行菌落pcr鉴定与扩培，pcr鉴定为阳性的菌株进行测序，序列经ncbi比对无误后，10％甘油保菌备用。
6.根据权利要求1所述的saa-小瓜虫感染的早期预警因子检测方法，其特征在于，s3.3中，测序结果经ncbi blast、editseq、dnaman去除载体序列...
【专利技术属性】
技术研发人员：贺扬，王均，王苗苗，付燕，蒋蕊泽，李华涛，李武，但宇，王亚东，王琦，皮小兰，
申请(专利权)人：内江师范学院，
类型：发明
国别省市：
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