【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于水稻基因工程领域，涉及一种利用敲除水稻果胶甲酯酶抑制蛋白编码基因ospmei28以提高水稻苗期耐冷胁迫能力的方法及其crispr/cas9靶dna序列。
技术介绍
1、水稻属于热带和亚热带作物，当环境温度低至16℃以下时水稻植株代谢和生理过程会出现不可逆伤害，即冷害(caton bp,foin tc,gibson kd,hill je(1998)atemperature-based model of direct-,water-seeded rice(oryza sativa)standestablishment in california.agricultural and forest meteorology,90(1):91-102.)，导致作物减产。世界上约有24个国家都遇到过严重冷害问题，全球每年因冷害减产的稻谷约30～50亿公斤(fei yb,shu nh,huang t,zhao sh(1994)cellula randbiochemical correlates to chilling and freezing tolerance inplant.biotechnology progress,14:40-43；韩龙植，朴钟泽，高熙宗(2003)水稻耐冷性对稻米品质冷水反应的影响.中国农业科学，36(7)：757-763)。
2、果胶是初生细胞壁的重要组成部分，在高尔基体中合成，并以完全甲基酯化的形式分泌到质外体中(wang x,wilson l,cosgrove dj.(2020)pect
技术实现思路
1、针对上述问题，本申请基于ospmei28编码果胶甲酯酶抑制蛋白与水稻苗期的耐冷胁迫能力的相关性，通过基因编辑的方法将水稻中该基因敲除，以提高水稻苗期的耐冷胁迫能力，获得新的耐冷水稻种质资源。
2、具体而言，本申请是通过如下方案实现专利技术目的的：
3、首先，本申请提供了一种基于水稻果胶甲酯酶抑制蛋白编码基因ospmei28的提高水稻苗期耐冷胁迫能力的方法，即对目标水稻进行基因编辑，使水稻ospmei28基因序列发生碱基缺失、插入或碱基替换，导致相应编码蛋白发生突变，以提高目标水稻苗期耐冷胁迫能力。
4、上述基因编辑是指向目的水稻材料转入可编辑位于水稻8号染色体的ospmei28基因的crispr/cas9基因编辑载体。该crispr/cas9基因编辑载体首先是根据如seq in no.2所示的靶dna设计grnaoligo序列，随后制备成oligo二聚体，然后将oligo二聚体构建至crispr/cas载体获得。
5、进一步而言，上述转入是指，将构建的基因编辑载体转化至农杆菌(如eha105)中并侵染目标水稻愈伤组织，以实现敲除目标水稻中的ospmei28基因的目的，获得基因敲除的转基因水稻植株。
6、上述ospmei28基因核苷酸序列如seq id no:1。
7、上述grnaoligo序列由核苷酸序列如seq in no.3所示的up oligo与核苷酸序列如seq in no.4所示的low oligo序列组成。
8、进一步而言，待敲除株系纯合稳定后，提取基因敲除植株dna，并以该dna为模板，以目标基因ospmei28的上游引物(核苷酸序列如seq id no:5所示)和下游引物(核苷酸序列如seq id no:6所示)为引物进行pcr扩增：然后对扩增产物进行测序，若敲除株系出现缺失、插入等纯合突变，同时其突变导致移码并导致该蛋白功能受阻，则认为该转基因水稻苗期耐冷胁迫能力提升。
9、其次，本申请提供了crispr/cas9系统编辑水稻ospmei28基因grnaoligo序列，由核苷酸序列如seq in no.3所示的up oligo与核苷酸序列如seq inno.4所示的low oligo序列组成。
10、本申请中，术语“基因敲除”或“敲除”是指ospmei28基因序列发生碱基缺失、插入或碱基替换，相应编码蛋白发生突变，所获得的基因编辑株系即为“基因敲除株系”。
11、与传统技术相比，本申请提供的方法具有以下有益效果：
12、1、本申请首次发现利用crispr/cas9技术将位于水稻8号染色体的ospmei28基因敲除后，水稻果胶甲酯化程度显著降低，水稻的耐冷能力显著上升，为提高植株的耐冷胁迫能力提供了新的方法。
13、2、本专利技术方法的实施不受遗传背景限制，在籼稻与粳稻中均可进行，也不存在传统育种过程中性状连锁的问题，通过基因工程的方法对目标植株进行基因敲除，即可获得耐冷胁迫能力提高的水稻植株。
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1.一种提高水稻苗期耐冷性的方法，其特征在于，具体步骤如下：对目标水稻进行基因编辑，使水稻OsPMEI28基因序列发生碱基缺失、插入或碱基替换，导致相应编码蛋白发生突变，以提高目标水稻苗期耐冷胁迫能力。
2.根据权利要求1所述提高水稻苗期耐冷性的方法，其特征在于，所述基因编辑是指向目的水稻材料转入可编辑OsPMEI28基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9基因编辑载体是根据如SEQ IN NO.2所示的靶DNA设计gRNA Oligo序列，随后制备成 Oligo二聚体，然后将 Oligo二聚体构建至CRISPR/Cas载体获得。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述转入是指，将所述基因编辑载体转化至农杆菌中并侵染目标水稻愈伤组织。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述gRNA Oligo序列由核苷酸序列如SEQIN NO.3所示的UP Oligo与核苷酸序列如SEQ IN NO.4所示的LOW Oligo序列组成。
6.根据权利
7.一种CRISPR/Cas9系统编辑水稻OsPMEI28基因的gRNA Oligo序列，所述序列该序列核苷酸序列如SEQ IN NO.3所示的UP Oligo与核苷酸序列如SEQ IN NO.4所示的LOW Oligo序列组成。
...【技术特征摘要】
1.一种提高水稻苗期耐冷性的方法，其特征在于，具体步骤如下：对目标水稻进行基因编辑，使水稻ospmei28基因序列发生碱基缺失、插入或碱基替换，导致相应编码蛋白发生突变，以提高目标水稻苗期耐冷胁迫能力。
2.根据权利要求1所述提高水稻苗期耐冷性的方法，其特征在于，所述基因编辑是指向目的水稻材料转入可编辑ospmei28基因的crispr/cas9基因编辑载体。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述crispr/cas9基因编辑载体是根据如seq in no.2所示的靶dna设计grna oligo序列，随后制备成 oligo二聚体，然后将 oligo二聚体构建至crispr/cas载体获得。
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【专利技术属性】
技术研发人员：陈梓春，肖宁，王志平，蔡跃，吴云雨，刘建菊，时薇，朱书豪，潘存红，周长海，李育红，黄年生，张小祥，季红娟，余玲，高鹏，李爱宏，
申请(专利权)人：江苏里下河地区农业科学研究所，
类型：发明
国别省市：
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