【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物试验，具体涉及一种农田土壤游离病毒显微计数的优化方法。
技术介绍
1、病毒是地球上丰度最高、种类最丰富的生物实体，由蛋白质外壳和核酸组成，细胞内寄生，可侵染生物界三域系统(细菌、古菌和真核生物域)中所有生物体。做为土壤微生物存亡的重要驱动者，病毒在调控宿主微生物参与的土壤生态功能中发挥着重要作用。当宿主细胞被病毒侵染后，土壤微生物生理代谢、基因表达和死亡速率发生变化，引起微生物数量、种群组成与功能发生改变同时宿主细胞释放出的大量有机物质，成为土壤生境中碳、氮等元素循环的有效底物与能量；最终影响土壤的物质循环以及能量流动。
2、随着测序技术的飞速发展，基于基因层面的土壤病毒研究被不断报导，然而，受病毒变异率影响，难以设计其通用引物，进而限制了土壤中病毒数量的定量观察和检测。尽管采用透射电子显微镜(tem)观察计数能够定量病毒数量，但检测区域小、高成本、准备工作复杂等缺点则限制着土壤病毒的计数研究。因此，采用荧光染料对土壤病毒核酸进行染色，结合荧光显微镜对其进行计数已成为定量分析土壤病毒的主要方法。
3、至目前为止，国内外采用荧光染色-显微计数法分析环境中病毒数量已有多篇报道，并初步建立了相应的试验流程，然而，这些研究方法多数为海洋生态系统中病毒的研究。关于农田土壤中病毒的研究方法多表现为因研究者而各异，且适应范围有限，研究结果缺乏进一步的验证与评估。
技术实现思路
1、本专利技术旨在至少在一定程度上解决上述相关技术中的技术问题之一。
<...【技术保护点】
1.一种农田土壤游离病毒显微计数的优化方法，其特征在于，所述方法从土壤病毒提取试验中的仪器选择、参数设置、土壤样品使用量以及显微观察关键影响因子这几个方面进行试验，分析农田土壤样品与病毒浸提液的比例、不同振荡仪器及参数设置、以及显微观察中防荧光淬灭剂和防褪色液对土壤病毒提取效率和显微计数的影响，根据分析结果优化农田土壤游离病毒显微计数的过程。
2.根据权利要求1所述的农田土壤游离病毒显微计数的优化方法，其特征在于，所述农田土壤样品与病毒浸提液的比例为100体积份病毒浸提液中加入不低于50质量份的农田土壤样品。
3.根据权利要求1所述的农田土壤游离病毒显微计数的优化方法，其特征在于，振荡仪器及参数设置为：使用手持搅拌棒在650 w、50 Hz条件下振荡3分钟实现土壤悬液的破碎。
4.根据权利要求1所述的农田土壤游离病毒显微计数的优化方法，其特征在于，所述防荧光淬灭剂为水溶性的抗荧光淬灭封片剂。
5.根据权利要求1所述的农田土壤游离病毒显微计数的优化方法，其特征在于，所述防褪色剂的制备方式为：将无水乙醇和(S)-(-)-α-甲基苄胺按体
6.根据权利要求2所述的农田土壤游离病毒显微计数的优化方法，其特征在于，所述病毒浸提液为pH=7.0的柠檬酸钾磷酸盐缓冲液。
7.根据权利要求6所述的农田土壤游离病毒显微计数的优化方法，其特征在于，所述柠檬酸钾磷酸盐缓冲液的制备方式为：将1.44份磷酸氢二钠、0.24份磷酸氢二钾和10.0份柠檬酸钾溶于HPLC水，加入磷酸调节pH至7.0后定容，将配制好的缓冲液通过微孔滤膜过滤，再进行灭菌操作，得到所述柠檬酸钾磷酸盐缓冲液。
8.根据权利要求1所述的农田土壤游离病毒显微计数的优化方法，其特征在于，根据分析结果优化后的农田土壤游离病毒显微计数的过程包括：
9.根据权利要求8所述的农田土壤游离病毒显微计数的优化方法，其特征在于，步骤S4中水浴反应的温度为37℃；
10.根据权利要求8所述的农田土壤游离病毒显微计数的优化方法，其特征在于，步骤S3中针孔滤膜为0.22μm针孔滤膜；
...【技术特征摘要】
1.一种农田土壤游离病毒显微计数的优化方法，其特征在于，所述方法从土壤病毒提取试验中的仪器选择、参数设置、土壤样品使用量以及显微观察关键影响因子这几个方面进行试验，分析农田土壤样品与病毒浸提液的比例、不同振荡仪器及参数设置、以及显微观察中防荧光淬灭剂和防褪色液对土壤病毒提取效率和显微计数的影响，根据分析结果优化农田土壤游离病毒显微计数的过程。
2.根据权利要求1所述的农田土壤游离病毒显微计数的优化方法，其特征在于，所述农田土壤样品与病毒浸提液的比例为100体积份病毒浸提液中加入不低于50质量份的农田土壤样品。
3.根据权利要求1所述的农田土壤游离病毒显微计数的优化方法，其特征在于，振荡仪器及参数设置为：使用手持搅拌棒在650 w、50 hz条件下振荡3分钟实现土壤悬液的破碎。
4.根据权利要求1所述的农田土壤游离病毒显微计数的优化方法，其特征在于，所述防荧光淬灭剂为水溶性的抗荧光淬灭封片剂。
5.根据权利要求1所述的农田土壤游离病毒显微计数的优化方法，其特征在于，所述防褪色剂的制备方式为：将无水乙醇和(s)-(-)-α-甲基苄胺...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘灵芝，王丰，梁敏杰，刘蕊，汪景宽，
申请(专利权)人：沈阳农业大学，
类型：发明
国别省市：
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