【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于硫酸软骨素生物合成的，尤其涉及一种高产硫酸软骨素的重组菌株及其应用和硫酸软骨素的制备方法。
技术介绍
1、硫酸软骨素（cs）是指一类酸性糖胺聚糖类大分子粘多糖，多以蛋白聚糖侧链的形式存在，cs广泛存在于动物结缔组织中，特别是软骨、皮肤、血管、韧带和肌腱。cs在治疗风湿病、骨质疏松症、关节炎、腰间盘突出等方面具有重要作用。在欧美、日本等国家，cs被广泛用于防治心脑血管疾病、动脉粥样硬化、骨关节炎等。cs常与氨基葡萄糖配合使用，可以刺激软骨细胞的增殖以及pgs、ⅱ型胶原、透明质酸的生物合成，从而缓解骨关节炎患者疼痛、减少关节肿胀和积液，对改善关节功能、治疗骨关节炎具有较好的疗效。
2、cs是由葡萄糖醛酸（glca）和n-乙酰氨基半乳糖（galnac）通过β-1,3和β-1,4糖苷键交替连接，并经过磺基转移酶对不同位点的磺酸化修饰形成的。磺酸化修饰指的是利用相应的磺基转移酶催化磺酸基团转移至glca的c-2位羟基或者galnac中c-4/c-6位羟基上的过程。根据结构中磺酸化修饰的位点不同，可将cs分为csa（glca-galnac(4s)）、csc（glca-galnac(6s)）、csd（glca(2s)-galnac(6s)）及cse（glca-galnac(4,6s)）。
3、目前，商品化cs主要是通过动物组织提取法制备获得的。动物组织提取法主要是利用牛、猪、鸡、鲨鱼等动物的软骨为原料提取得到cs。但是，通过该方法提取得到的cs后续还需要经过复杂繁琐的纯化处理，且所得的产品还可能引发免疫反
4、在公开号为cn102869782a的中国专利技术中公开了通过e.coli o5:k4:h4的发酵制备k4荚膜多糖，随后对所得k4荚膜多糖进行水解获得89%的软骨素，纯度为90%，分子量在45kda左右。但是，所获得的软骨素是以果糖基化形式存在，还需要进行大量的化学或酶修饰才能最终获得硫酸软骨素。在cn106497845a的中国专利技术中公开了对枯草芽孢杆菌中的软骨素合成路径进行优化以提高软骨素的产量，但是所得cs中结构组成较为复杂，无法很好地实现对特定结构cs的有效合成。
技术实现思路
1、本专利技术的第一目的在于提供一种产硫酸软骨素的重组菌株。该重组菌株具有优秀的高效合成csa的能力，采用其进行发酵即可实现csa的高产量以及高纯度的制备，不需要进行额外的化学或酶修饰，有效地解决了现有微生物发酵法中所存在的制备工艺复杂、硫酸软骨素产量低以及纯度低等问题，具有操作简便、所得产品生物安全性高以及易于实现大规模生产等优点，具有良好的应用前景。
2、本专利技术的第二目的在于提供上述产硫酸软骨素的重组菌株在微生物发酵法制备硫酸软骨素中的应用。
3、本专利技术的第三目的在于提供一种硫酸软骨素的制备方法。
4、具体的，本专利技术提供的产硫酸软骨素的重组菌株能够合成表达udp-氨基葡萄糖异构酶、udp-葡萄糖脱氢酶、软骨素聚合酶、氨基葡萄糖合成酶、磷酸葡萄糖胺变位酶、udp-n-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶、atp磺化酶、磺基转移酶、丙酮酸激酶以及aps激酶。
5、进一步地，重组菌株具有以下至少一种特征：所述udp-氨基葡萄糖异构酶包括序列如seq id no:10所示的氨基酸片段；所述udp-葡萄糖脱氢酶包括序列如seq id no:11所示的氨基酸片段；所述软骨素聚合酶包括序列如seq id no:12所示的氨基酸片段；所述氨基葡萄糖合成酶包括序列如seq id no:22所示的氨基酸片段；所述磷酸葡萄糖胺变位酶包括序列如seq id no:23所示的氨基酸片段；所述udp-n-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶包括序列如seq id no:24所示的氨基酸片段；所述葡萄糖-6-磷酸异构酶包括序列如seq id no:34所示的氨基酸片段；所述葡萄糖磷酸变位酶包括序列如seq id no:35所示的氨基酸片段；所述葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶包括序列如seq id no:36所示的氨基酸片段；所述atp磺化酶包括序列如seq id no:49所示的氨基酸片段；所述磺基转移酶包括序列如seqid no:50所示的氨基酸片段；所述丙酮酸激酶包括序列如seq id no:51所示的氨基酸片段；所述aps激酶包括序列如seq id no:52所示的氨基酸片段。
6、进一步地，所述重组菌株选自大肠杆菌、毕赤酵母和酿酒酵母中的一种或多种。
7、进一步地，重组菌株具有以下至少一种特征：编码所述udp-氨基葡萄糖异构酶的kfoa基因包括序列如seq id no:1所示的核苷酸片段；编码所述udp-葡萄糖脱氢酶的kfof基因包括序列如seq id no:2所示的核苷酸片段；编码所述软骨素聚合酶的kfoc基因包括序列如seq id no:3所示的核苷酸片段；编码所述氨基葡萄糖合成酶的glms基因包括序列如seq id no:13所示的核苷酸片段；编码所述磷酸葡萄糖胺变位酶的glmm基因包括序列如seq id no:14所示的核苷酸片段；编码所述udp-n-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶的glmu基因包括序列如seq id no:15所示的核苷酸片段；编码所述葡萄糖-6-磷酸异构酶的pgi基因包括序列如seq id no:25所示的核苷酸片段；编码所述葡萄糖磷酸变位酶的pgm基因包括序列如seq id no:26所示的核苷酸片段；编码所述葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的galu基因包括序列如seq id no:27所示的核苷酸片段；编码所述atp磺化酶的atps基因包括序列如seq id no:37所示的核苷酸片段；编码所述磺基转移酶的st基因包括序列如seq id no:38所示的核苷酸片段；编码所述丙酮酸激酶的pyka基因包括序列如seq id no:39所示的核苷酸片段；编码所述aps激酶的apsk基因包括序列如seq id no:40所示的核苷酸片段。
8、本专利技术还提供了上述产硫酸软骨素的重组菌株在微生物发酵法制备硫酸软骨素中的应用。
9、本专利技术提供的硫酸软骨素的制备方法包括：取上述产硫酸软骨素的重组菌株进行发酵处理得到所述硫酸软骨素。
10、进一步地，所述发酵处理包括：s1、取所述重组菌株接种于发酵培养基，进行预培养，得到预处理培养液；s2、取诱导表达剂加入所述预处理培养液，进行诱导表达，得到含有所述硫酸软骨素的上清液。
11、进一步地，步骤s1中，所述发酵培养基包括质量比为(5~20):(1~4):(2~5):(1~3):(5~20)的甘油、柠檬酸、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生物b1和有机氮源。
12、进一步地，步骤s1中，所述有机氮源选自大豆蛋白胨、酵母粉和尿素中的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种产硫酸软骨素的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株合成能够表达UDP-氨基葡萄糖异构酶、UDP-葡萄糖脱氢酶、软骨素聚合酶、氨基葡萄糖合成酶、磷酸葡萄糖胺变位酶、UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶、ATP磺化酶、磺基转移酶、丙酮酸激酶以及APS激酶。
2.根据权利要求1所述的产硫酸软骨素的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株具有以下至少一种特征：
3.根据权利要求1所述的产硫酸软骨素的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株选自大肠杆菌、毕赤酵母和酿酒酵母中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的产硫酸软骨素的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株具有以下至少一种特征：
5.权利要求1~4中任意一项所述的产硫酸软骨素的重组菌株在微生物发酵法制备硫酸软骨素中的应用。
6.一种硫酸软骨素的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：取权利要求1~4中任意一项所述的产硫酸软骨素的重组菌株进行发酵处理得到所述硫酸软骨素。
7.根据权利要求6所述的硫酸软骨
8.根据权利要求7所述的硫酸软骨素的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述发酵培养基包括质量比为(5~20):(1~4):(2~5):(1~3):(5~20)的甘油、柠檬酸、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生物B1和有机氮源；其中，所述有机氮源选自大豆蛋白胨、酵母粉和尿素中的一种或多种。
9.根据权利要求7所述的硫酸软骨素的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述预培养的温度为35~40℃，时间为1~10h。
10.根据权利要求7所述的硫酸软骨素的制备方法，其特征在于，步骤S1中，步骤S2中，所述诱导表达的温度为35~40℃，时间为48~72h。
11.根据权利要求7所述的硫酸软骨素的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述诱导表达还包括补料处理，所述补料处理包括：监测所述预处理培养液的溶氧量，当所述溶氧量为20%以上时，取补料培养基添加至预处理培养液以调控预处理培养液的溶氧量为15~40%。
12.根据权利要求11所述的硫酸软骨素的制备方法，其特征在于，所述补料培养基包括250~1000g/L的甘油、100~500g/L的蛋白胨和5~20g/L的硫酸镁。
...【技术特征摘要】
1.一种产硫酸软骨素的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株合成能够表达udp-氨基葡萄糖异构酶、udp-葡萄糖脱氢酶、软骨素聚合酶、氨基葡萄糖合成酶、磷酸葡萄糖胺变位酶、udp-n-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、葡萄糖磷酸变位酶、葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶、atp磺化酶、磺基转移酶、丙酮酸激酶以及aps激酶。
2.根据权利要求1所述的产硫酸软骨素的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株具有以下至少一种特征：
3.根据权利要求1所述的产硫酸软骨素的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株选自大肠杆菌、毕赤酵母和酿酒酵母中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的产硫酸软骨素的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株具有以下至少一种特征：
5.权利要求1~4中任意一项所述的产硫酸软骨素的重组菌株在微生物发酵法制备硫酸软骨素中的应用。
6.一种硫酸软骨素的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：取权利要求1~4中任意一项所述的产硫酸软骨素的重组菌株进行发酵处理得到所述硫酸软骨素。
7.根据权利要求6所述的硫酸软骨素的制备方法，其特征在于，所述发酵处理包括：s1、取所述重组菌株接种于发酵培养基，进行预培养，得到预处理培养液；...
【专利技术属性】
技术研发人员：祝俊，徐飞，张兴意，陈必钦，朱志春，马立清，李丹，
申请(专利权)人：内蒙古金达威药业有限公司，
类型：发明
国别省市：
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