【技术实现步骤摘要】
本申请属于医药领域，具体涉及一种经应激诱导的间充质干细胞提取物的活性检测方法。
技术介绍
1、间充质干细胞(mesenchymal stemcells，mscs)具有自我复制和多向分化潜能，广泛存在于骨髓、脂肪、滑膜、牙髓、羊水、胎盘、脐带、胚胎、脐带血、羊膜、外周血、肌肉、尿液等组织，具有来源广泛、无需配型、感染率低、分化潜能强、增殖能力强、采集方便等特点。通过刺激mscs，之后裂解mscs，可以从细胞裂解液中可以分离纯化获得一种具有生物修复活性的间充质干细胞提取物。该间充质干细胞提取物在已完成的动物及临床实验中取得了显著的效果，具有明确的成药可能，现已进入临床实验阶段。
2、间充质干细胞能够产生干细胞生长因子(scf)、神经生长因子(ngf)、白介素-6(il-6)、白介素-7(il-7)、肿瘤坏死因子(tnf)、干扰素(ifn)等活性因子，参与调节细胞生长、细胞凋亡、细胞分化、抗病毒、免疫成熟等过程，可用于免疫调节、关节组织修复及治疗急性肺损伤、重症肺炎、急性呼吸窘迫综合征等疾病。然而，现有阶段，间充质干细胞提取物是通过刺激间充质干细胞表达、分离纯化得到，这导致其通常具备很显著的批次间的性能差异，因此需要明确一种评价间充质干细胞提取物对被诱发炎症的细胞的抗炎促修复的效果的检测方法，监控间充质干细胞提取物的抗炎性能，减小间充质干细胞提取物的批次间差异，提高产品的质量稳定性，同时，对于探究间充质干细胞提取物的抗炎活性变化规律以及最佳用药浓度，有着非常重要的意义。
技术实现思路p>
1、本申请的专利技术人发现在适当应激条件下培养间充质干细胞后，裂解应激培养的干细胞可以在其裂解物中分离多种蛋白质，所分离得到的组合有多种蛋白质的间充质干细胞提取物具有抗炎修复活性，能够用于治疗神经系统和关节组织损伤，设计一种活性检测方法可以用于准确评价间充质干细胞提取物的抗炎活性。
2、本申请所采取的技术方案是：
3、一种经应激诱导的间充质干细胞提取物的活性检测方法，所述活性检测方法包括以下步骤：s1：采用bv2细胞，以n×104个细胞每孔的密度接种至孔板内，预培养20h-28h，4.5≤n≤5.5；s2：采用所述间充质干细胞提取物配制至少3组不同浓度的活性检测培养基，每组所述活性检测培养基中的所述间充质干细胞提取物的浓度均在预设浓度范围内；s3：根据所述bv2细胞建立模型组和给药组，将所述模型组和所述给药组内的所述bv2细胞转移至含有450ng/ml-550ng/ml脂多糖的培养基，培养20h-28h；s4：将所述模型组的所述bv2细胞转移至空白的培养基，将所述给药组的所述bv2细胞分别转移至各组所述活性检测培养基：s5：继续孵育所述bv2细胞12h或24h，离心，取上清液；以及s6：取所述上清液进行elisa检测，得到炎症因子的浓度，通过比对所述模型组与所述给药组的炎症因子浓度，评价所述间充质干细胞提取物的抗炎活性；其中，所述间充质干细胞提取物的制备包括以下步骤：s001：培养间充质干细胞并制造应激条件刺激所述间充质干细胞；s002：将所述s001中得到的所述间充质干细胞裂解、分离、纯化得到所述间充质干细胞提取物。
4、在一些方法的实施例中，所述s3还包括：根据所述bv2细胞建立抗炎阳性对照组和抗炎阴性对照组，将所述抗炎阳性对照组和所述抗炎阴性对照组转移至所述含有450ng/ml-550ng/ml脂多糖的培养基培养20h-28h；所述s4还包括将所述抗炎阳性对照组内的所述bv2细胞转移至添加有5mm丁酸钠的培养基，将所述抗炎阴性对照组内的所述bv2细胞转移至添加有1000ng/ml安慰剂的培养基，所述安慰剂为人血白蛋白；所述s5还包括继续孵育所述抗炎阳性对照组和所述抗炎阴性对照组内的所述bv2细胞12h或24h，离心，取上清液；所述s6还包括取所述抗炎阳性对照组和所述抗炎阴性对照组内的上清液进行elisa检测，得到所述炎症因子的浓度，通过分别比对所述模型组与所述抗炎阴性对照组和所述抗炎阳性对照组的炎症因子浓度以评价所述elisa检测的数据的可信度，以及，通过分别比对所述给药组、所述抗炎阴性对照组和所述抗炎阳性对照组的炎症因子浓度以评价不同浓度的所述间充质干细胞提取物的抗炎活性的强弱。
5、在一些方法的实施例中，所述s6中，所述炎症因子包括il-1β、tnf-α和il-6中的一种或者多种的组合。
6、在一些方法的实施例中，在所述s1前，所述活性检测方法还包括以下步骤：s01：采用所述bv2细胞，以m×103个细胞每孔的密度接种至孔板内，预培养20h-28h，7.5≤m≤8.5；s02：采用所述间充质干细胞提取物配制至少3组不同浓度的毒性检测培养基；s03：根据所述bv2细胞建立空白对照组、毒性阴性对照组、毒性阳性对照组和测试组，所述空白对照组为空白培养基中孵育，所述毒性阴性对照组和所述毒性阳性对照组分别在加入有安慰剂和丁酸钠的培养基中孵育，所述测试组在各组所述毒性检测培养基中孵育，所述安慰剂为人血白蛋白；s04：孵育所述bv2细胞12h或24h；s05：在每孔所述bv2细胞内分别加入10 μl的cck-8溶液，继续孵育1h-2h；以及s06：使用酶标仪测得所述bv2细胞的细胞活力，通过比对所述空白对照组分别与所述毒性阴性对照组以及所述毒性阳性对照组的细胞活力大小，以评价所述酶标仪的数据的可信度；将所述测试组分别与所述毒性阴性对照组以及所述毒性阳性对照组进行比对，其中，细胞活力大于等于所述毒性阴性对照组的所述测试组所对应的所述毒性检测培养基判定为对所述bv2细胞无毒，细胞活力小于所述毒性阳性对照组的所述测试组所对应的所述毒性检测培养基判定为对所述bv2细胞有毒，在被判定为无毒的所述毒性检测培养基所包括的所述间充质干细胞提取物的浓度中的最大值与最小值构成的浓度范围中剔除，被判定为有毒的所述毒性检测培养基包括的所述间充质干细胞提取物的浓度中的最大值与最小值构成的浓度范围后，保留下来的浓度范围作为所述预设浓度范围。
7、在一些方法的实施例中，所述预设浓度范围为10ng/ml-1000 ng/ml。
8、在一些方法的实施例中，所述活性检测培养基包括6组，且6组所述活性检测培养基中的所述间充质干细胞提取物的浓度分别为10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、500ng/ml以及1000ng/ml。
9、在一些方法的实施例中，所述s01-所述s03以及所述s1-所述s4步骤中用于培养所述bv2细胞的培养基为包括血清的培养基，所述bv2细胞的孵育条件为37℃和5% co2。
10、在一些方法的实施例中，所述培养基为包括有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的dmem培养基。
11、在一些方法的实施例中，所述s6包括以下步骤：s61：取包括所述炎症因子的标准品，梯度稀释，制备所述标准品在450nm处的od值-所述炎症因子浓度的标准曲线；s62：按照预定稀释比例在所述上清液加入缓冲液形成待测样品，取预定本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种经应激诱导的间充质干细胞提取物的活性检测方法，其特征在于，所述活性检测方法包括以下步骤：S1：采用BV2细胞，以N×104个细胞每孔的密度接种至孔板内，预培养20h-28h，4.5≤N≤5.5；S2：采用所述间充质干细胞提取物配制至少3组不同浓度的活性检测培养基，每组所述活性检测培养基中的所述间充质干细胞提取物的浓度均在预设浓度范围内；S3：根据所述BV2细胞建立模型组和给药组，将所述模型组和所述给药组内的所述BV2细胞转移至含有450ng/mL-550ng/mL脂多糖的培养基，培养20h-28h；S4：将所述模型组的所述BV2细胞转移至空白的培养基，将所述给药组的所述BV2细胞分别转移至各组所述活性检测培养基：S5：继续孵育所述BV2细胞12h或24h，离心，取上清液；以及S6：取所述上清液进行Elisa检测，得到炎症因子的浓度，通过比对所述模型组与所述给药组的炎症因子浓度，评价所述间充质干细胞提取物的抗炎活性；其中，所述间充质干细胞提取物的制备包括以下步骤：S001：培养间充质干细胞并制造应激条件刺激所述间充质干细胞；S002：将所述S001中得到的所述间充质干细胞裂
2.根据权利要求1所述的活性检测方法，其特征在于，所述S3还包括：根据所述BV2细胞建立抗炎阳性对照组和抗炎阴性对照组，将所述抗炎阳性对照组和所述抗炎阴性对照组转移至所述含有450ng/mL-550ng/mL脂多糖的培养基培养20h-28h；所述S4还包括将所述抗炎阳性对照组内的所述BV2细胞转移至添加有5mM丁酸钠的培养基，将所述抗炎阴性对照组内的所述BV2细胞转移至添加有1000ng/mL安慰剂的培养基，所述安慰剂为人血白蛋白；所述S5还包括继续孵育所述抗炎阳性对照组和所述抗炎阴性对照组内的所述BV2细胞12h或24h，离心，取上清液；所述S6还包括取所述抗炎阳性对照组和所述抗炎阴性对照组内的上清液进行Elisa检测，得到所述炎症因子的浓度，通过分别比对所述模型组与所述抗炎阴性对照组和所述抗炎阳性对照组的炎症因子浓度以评价所述Elisa检测的数据的可信度，以及，通过分别比对所述给药组、所述抗炎阴性对照组和所述抗炎阳性对照组的炎症因子浓度以评价不同浓度的所述间充质干细胞提取物的抗炎活性的强弱。
3.根据权利要求1所述的活性检测方法，其特征在于，所述S6中，所述炎症因子包括IL-1β、TNF-α和IL-6中的一种或者多种的组合。
4.根据权利要求1所述的活性检测方法，其特征在于，在所述S1前，所述活性检测方法还包括以下步骤：S01：采用所述BV2细胞，以M×103个细胞每孔的密度接种至孔板内，预培养20h-28h，7.5≤M≤8.5；S02：采用所述间充质干细胞提取物配制至少3组不同浓度的毒性检测培养基；S03：根据所述BV2细胞建立空白对照组、毒性阴性对照组、毒性阳性对照组和测试组，所述空白对照组为空白培养基中孵育，所述毒性阴性对照组和所述毒性阳性对照组分别在加入有安慰剂和丁酸钠的培养基中孵育，所述测试组在各组所述毒性检测培养基中孵育，所述安慰剂为人血白蛋白；S04：孵育所述BV2细胞12h或24h；S05：在每孔所述BV2细胞内分别加入10 μL的CCK-8溶液，继续孵育1h-2h；以及S06：使用酶标仪测得所述BV2细胞的细胞活力，通过比对所述空白对照组分别与所述毒性阴性对照组以及所述毒性阳性对照组的细胞活力大小，以评价所述酶标仪的数据的可信度；将所述测试组分别与所述毒性阴性对照组以及所述毒性阳性对照组进行比对，其中，所述细胞活力大于等于所述毒性阴性对照组的所述测试组所对应的所述毒性检测培养基判定为对所述BV2细胞无毒，所述细胞活力小于所述毒性阳性对照组的所述测试组所对应的所述毒性检测培养基判定为对所述BV2细胞有毒，在被判定为无毒的所述毒性检测培养基所包括的所述间充质干细胞提取物的浓度中的最大值与最小值构成的浓度范围中，剔除被判定为有毒的所述毒性检测培养基包括的所述间充质干细胞提取物的浓度中的最大值与最小值构成的浓度范围后，保留下来的浓度范围作为所述预设浓度范围。
5.根据权利要求4所述的活性检测方法，其特征在于，所述预设浓度范围为10ng/mL-1000 ng/mL。
6.根据权利要求5所述的活性检测方法，其特征在于，所述活性检测培养基包括6组，且6组所述活性检测培养基中的所述间充质干细胞提取物的浓度分别为10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL以及1000ng/mL。
7.根据权利要求4所述的活性检测方法，其特征在于，所述S01-所述S03以及所述S1-所述S4步骤中用于培养所...
【技术特征摘要】
1.一种经应激诱导的间充质干细胞提取物的活性检测方法，其特征在于，所述活性检测方法包括以下步骤：s1：采用bv2细胞，以n×104个细胞每孔的密度接种至孔板内，预培养20h-28h，4.5≤n≤5.5；s2：采用所述间充质干细胞提取物配制至少3组不同浓度的活性检测培养基，每组所述活性检测培养基中的所述间充质干细胞提取物的浓度均在预设浓度范围内；s3：根据所述bv2细胞建立模型组和给药组，将所述模型组和所述给药组内的所述bv2细胞转移至含有450ng/ml-550ng/ml脂多糖的培养基，培养20h-28h；s4：将所述模型组的所述bv2细胞转移至空白的培养基，将所述给药组的所述bv2细胞分别转移至各组所述活性检测培养基：s5：继续孵育所述bv2细胞12h或24h，离心，取上清液；以及s6：取所述上清液进行elisa检测，得到炎症因子的浓度，通过比对所述模型组与所述给药组的炎症因子浓度，评价所述间充质干细胞提取物的抗炎活性；其中，所述间充质干细胞提取物的制备包括以下步骤：s001：培养间充质干细胞并制造应激条件刺激所述间充质干细胞；s002：将所述s001中得到的所述间充质干细胞裂解、分离、纯化得到所述间充质干细胞提取物。
2.根据权利要求1所述的活性检测方法，其特征在于，所述s3还包括：根据所述bv2细胞建立抗炎阳性对照组和抗炎阴性对照组，将所述抗炎阳性对照组和所述抗炎阴性对照组转移至所述含有450ng/ml-550ng/ml脂多糖的培养基培养20h-28h；所述s4还包括将所述抗炎阳性对照组内的所述bv2细胞转移至添加有5mm丁酸钠的培养基，将所述抗炎阴性对照组内的所述bv2细胞转移至添加有1000ng/ml安慰剂的培养基，所述安慰剂为人血白蛋白；所述s5还包括继续孵育所述抗炎阳性对照组和所述抗炎阴性对照组内的所述bv2细胞12h或24h，离心，取上清液；所述s6还包括取所述抗炎阳性对照组和所述抗炎阴性对照组内的上清液进行elisa检测，得到所述炎症因子的浓度，通过分别比对所述模型组与所述抗炎阴性对照组和所述抗炎阳性对照组的炎症因子浓度以评价所述elisa检测的数据的可信度，以及，通过分别比对所述给药组、所述抗炎阴性对照组和所述抗炎阳性对照组的炎症因子浓度以评价不同浓度的所述间充质干细胞提取物的抗炎活性的强弱。
3.根据权利要求1所述的活性检测方法，其特征在于，所述s6中，所述炎症因子包括il-1β、tnf-α和il-6中的一种或者多种的组合。
4.根据权利要求1所述的活性检测方法，其特征在于，在所述s1前，所述活性检测方法还包括以下步骤：s01：采用所述bv2细胞，以m×103个细胞每孔的密度接种至孔板内，预培养20h-28h，7.5≤m≤8.5；s02：采用所述间充质干细胞提取物配制至少3组不同浓度的毒性检测培养基；s03：根据所述bv2细胞建立空白对照组、毒性阴性对照组、毒性阳性对照组和测试组，所述空白对照组为空白培养基中孵育，所述毒性阴性对照组和所述毒性阳性对照组分别在加入有安慰剂和丁酸钠的培养基中孵育，所述测试组在各组所述毒性检测培养基中孵育，所述安慰剂为人血白蛋白；s04：孵育所述bv2细胞12h或24h；s05：在每孔所述bv2细胞内分别加入10 μl的cc...
【专利技术属性】
技术研发人员：王宇，王伊龙，李付鸾，
申请(专利权)人：北京达尔文细胞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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