【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于酶工程与生物催化领域，具体涉及一种高稳定性固定化南极假丝酵母脂肪酶b及其制备方法和应用。
技术介绍
1、脂肪酶作为重要的工业用酶广泛应用于食品加工、油脂改性、生物柴油制备、手性化合物拆分等领域，具有选择性高、催化条件温和、环境友好等特点。虽然脂肪酶在工业上有着巨大的应用潜能，但大多数游离脂肪酶制备成本高、操作稳定性低，在有机相中易结块，大大降低了脂肪酶的利用率，并且游离脂肪酶回收和再利用困难，导致脂肪酶的应用成本高。脂肪酶的固定化形态在多种性质上均优于游离态。酶经固定化后，具有稳定性高、易回收、可反复使用、成本低等优点。
2、南极假丝酵母脂肪酶b（candida antarctica lipase b, calb）对众多脂类物质都表现出较高的催化活性，是目前应用最广泛的脂肪酶，也是商业化最成功的脂肪酶。目前，应用最广泛的固定化calb是丹麦诺维信的novozym 435，然而novozym 435价格昂贵（15000元/kg以上），且其制备技术一直被诺维信公司所垄断，严重制约了我国生物酶催化技术的发展。针对目前国内固定化酶自主研发能力不足，缺乏具有自主知识产权的固定化酶制备技术，固定化脂肪酶严重依赖进口的现状，迫切需要开展固定化脂肪酶制备技术的研究。
3、研究表明，大多数脂肪酶是界面活化酶，其活性中心被一个“盖子”结构覆盖。“盖子”的内部疏水而外部亲水。因此，当脂肪酶与疏水表面接触时，脂肪酶的构象发生变化，“盖子”打开，活性中心暴露在反应介质中，从而促进活性中心与底物相互作用，大大增加了脂肪
4、共价结合法是应用最广泛的固定化方法之一，它是将酶分子表面的官能团与载体材料的活性基团通过共价键进行连接的一种方法。共价键使得酶与载体之间结合牢固，从而使该方法制备的固定化酶具有很高的稳定性。通常为了使这些反应发生，载体的表面必须被修饰或功能化。其中最常见的修饰剂是戊二醛（glutaraldehyde, ga），然而ga本身具有毒性，不仅会造成环境污染，而且过高剂量可能会抑制脂肪酶活性。纤维素是一种来源广泛的绿色无毒植物多糖，具有良好的稳定性和生物相容性，可制备成醛衍生物用于酶的交联和固定化。
5、cn 116463327 a公开了一种以酰氯改性的氨基树脂为载体的固定化脂肪酶及其制备方法与应用，将酰氯偶联在氨基树脂上，得到酰氯改性的氨基树脂，将脂肪酶吸附在改性树脂上，再以京尼平作为交联剂制备固定化酶，将固定化酶催化油酸和甘油反应生成1,3-甘油二酯，在重复使用10次时，1,3-甘油二酯的含量为初始值的89%。cn 110331139 a公开了一种南极假丝酵母脂肪酶b的固定化方法，将二甲基咪唑水溶液、硝酸锌水溶液与calb混合，以大孔吸附树脂作为固定化载体、聚乙烯亚胺作为交联剂制备固定化calb，固定化酶催化油酸和甲醇反应10个批次，相对活性保持在85%左右。
6、总之，目前实验室制备的固定化calb活力与novozym 435相当或更高，但稳定性与novozym 435相比仍存在较大差距。因此，我们提出一种制备方法，旨在获得稳定性好、活的固定化calb。
技术实现思路
1、本专利技术为了提高固定化脂肪酶的稳定性，提供本专利技术的目的在于提供一种高稳定性固定化南极假丝酵母脂肪酶b及其制备方法和应用，本专利技术通过硅烷偶联剂和二醛纤维素对固定化载体的树脂进行改性，将其用于南极假丝酵母脂肪酶b的固定化，从而得到较高稳定性和活性的南极假丝酵母脂肪酶b。
2、为达到上述目的，本专利技术提供以下技术方案：
3、本专利技术提供一种高稳定性固定化南极假丝酵母脂肪酶b的制备方法，包括以下步骤：
4、向去离子水和无水乙醇的混合溶液中加入硅烷偶联剂混合均匀得到共混溶液，在共混溶液中加入树脂混合均匀得悬浮液，对悬浮液进行加热，直至液体完全蒸发，向蒸发后得到的产物中加入无水乙醇再进行蒸发，得到硅烷化树脂；
5、取二醛纤维加入氢氧化钠-尿素溶液中，再加入去离子水和硅烷化树脂混合均匀，混合后的溶液进行恒温振荡处理，恒温振荡处理后调节ph至中性得到树脂粗产物，对树脂粗产物进行洗涤并干燥，得到烷基-醛基改性树脂；
6、将烷基-醛基改性树脂加入南极假丝酵母脂肪酶b酶液与缓冲液的混合溶液中混合均匀，混合后的溶液置于恒温环境中对南极假丝酵母脂肪酶b进行固化，固化处理后分离出固定化酶，用缓冲液洗涤固定化酶，直至滤液中无蛋白检出，再进行干燥得到固定化南极假丝酵母脂肪酶b。
7、所述去离子水和无水乙醇的混合溶液中去离子水和无水乙醇的体积比为1:2~1:4；
8、所述硅烷偶联剂为苯基三乙氧基硅烷、辛基三乙氧基硅烷、十二烷基三乙氧基硅烷中的一种，硅烷偶联剂的添加量为去离子水和无水乙醇总体积的5%～10%。
9、所述树脂为ecr1030大孔吸附树脂，每毫升共混溶液中加入0.02g~0.05g树脂。
10、所述在共混溶液中加入树脂混合均匀得到悬浮液，对悬浮液进行加热，直至液体完全蒸发，向蒸发后得到的产物中加入无水乙醇再进行蒸发，得到硅烷化树脂，具体为：
11、在共混溶液中加入树脂，通过超声分散处理0.5 h~1 h后得到悬浮液，在温度为80℃~95℃的环境中对悬浮液进行加热，直到液体完全蒸发；向蒸发后得到的产物中加入无水乙醇再进行蒸发，重复2～3次；再用无水乙醇和去离子水洗涤，在温度为40℃~45℃的环境中干燥8 h ~10 h得到硅烷化树脂。
12、所述氢氧化钠-尿素水溶液为7%的氢氧化钠和12%的尿素水溶液，二醛纤维素与硅烷化树脂的质量比为1:6～1:7，去离子水添加量为氢氧化钠-尿素水溶液体积的15~20倍。
13、所述取二醛纤维加入氢氧化钠-尿素溶液中，再加入去离子水和硅烷化树脂混合均匀，混合后的溶液进行恒温振荡处理，恒温振荡处理后调节ph至中性得到树脂粗产物，对树脂粗产物进行洗涤并干燥，得到烷基-醛基改性树脂，具体为：
14、取二醛纤维素加入氢氧化钠-尿素水溶液中混合均匀，加入去离子水和硅烷化树脂后超声10 min~30 min，在温度为40℃~45℃，转速为120 rpm~150 rpm的条件下恒温振荡2 h~4 h，恒温振荡处理后用盐酸溶液调节ph至中性得到树脂粗产物，用无水乙醇和去离子水洗涤树脂粗产物，在温度为40℃~45℃的环境中干燥8 h ~10 h得到烷基-醛基改性树脂。
15、所述缓冲液为0.02 mol/l、ph为7的磷酸盐缓冲液，南极假丝酵母脂肪酶本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高稳定性固定化南极假丝酵母脂肪酶B的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种高稳定性固定化南极假丝酵母脂肪酶B的制备方法，其特征在于，所述去离子水和无水乙醇的混合溶液中去离子水和无水乙醇的体积比为1:2~1:4；
3.根据权利要求1所述的一种高稳定性固定化南极假丝酵母脂肪酶B的制备方法，其特征在于，所述树脂为ECR1030大孔吸附树脂，每毫升共混溶液中加入0.02g~0.05g树脂。
4.根据权利要求1所述的一种高稳定性固定化南极假丝酵母脂肪酶B的制备方法，其特征在于，所述在共混溶液中加入树脂混合均匀得到悬浮液，对悬浮液进行加热，直至液体完全蒸发，向蒸发后得到的产物中加入无水乙醇再进行蒸发，得到硅烷化树脂，具体为：
5.根据权利要求1所述的一种高稳定性固定化南极假丝酵母脂肪酶B的制备方法，其特征在于，所述氢氧化钠-尿素水溶液为7%的氢氧化钠和12%的尿素水溶液，二醛纤维素与硅烷化树脂的质量比为1:6～1:7，去离子水添加量为氢氧化钠-尿素水溶液体积的15~20倍。
6.根据权利要求1所述
7.根据权利要求1所述的一种高稳定性固定化南极假丝酵母脂肪酶B的制备方法，其特征在于，所述缓冲液为0.02 mol/L、pH为7的磷酸盐缓冲液，南极假丝酵母脂肪酶B酶液与缓冲液的体积比为1:1，烷基-醛基改性树脂的添加量为80 mg/g~120 mg/g，mg/g表示南极假丝酵母脂肪酶B酶液中每克酶蛋白中加入烷基-醛基改性树脂的量。
8.根据权利要求1所述的一种高稳定性固定化南极假丝酵母脂肪酶B的制备方法，其特征在于，所述将烷基-醛基改性树脂加入南极假丝酵母脂肪酶B酶液与缓冲液的混合溶液中混合均匀，混合后的溶液置于恒温环境中对南极假丝酵母脂肪酶B进行固化，固化处理后分离出固定化酶，用缓冲液洗涤固定化酶，直至滤液中无蛋白检出，再进行干燥得到固定化南极假丝酵母脂肪酶B，具体为：
9.根据权利要求1-8任意一项所述的制备方法制得的高稳定性固定化南极假丝酵母脂肪酶B，其特征在于，南极假丝酵母脂肪酶B的氨基与烷基-醛基改性树脂表面的醛基发生共价结合。
10.根据权利要求9所述的高稳定性固定化南极假丝酵母脂肪酶B在功能性油脂制备、高酸价油脂脱酸和生物燃料制备领域应用。
...【技术特征摘要】
1.一种高稳定性固定化南极假丝酵母脂肪酶b的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种高稳定性固定化南极假丝酵母脂肪酶b的制备方法，其特征在于，所述去离子水和无水乙醇的混合溶液中去离子水和无水乙醇的体积比为1:2~1:4；
3.根据权利要求1所述的一种高稳定性固定化南极假丝酵母脂肪酶b的制备方法，其特征在于，所述树脂为ecr1030大孔吸附树脂，每毫升共混溶液中加入0.02g~0.05g树脂。
4.根据权利要求1所述的一种高稳定性固定化南极假丝酵母脂肪酶b的制备方法，其特征在于，所述在共混溶液中加入树脂混合均匀得到悬浮液，对悬浮液进行加热，直至液体完全蒸发，向蒸发后得到的产物中加入无水乙醇再进行蒸发，得到硅烷化树脂，具体为：
5.根据权利要求1所述的一种高稳定性固定化南极假丝酵母脂肪酶b的制备方法，其特征在于，所述氢氧化钠-尿素水溶液为7%的氢氧化钠和12%的尿素水溶液，二醛纤维素与硅烷化树脂的质量比为1:6～1:7，去离子水添加量为氢氧化钠-尿素水溶液体积的15~20倍。
6.根据权利要求1所述的一种高稳定性固定化南极假丝酵母脂肪酶b的制备方法，其特征在于，所述取二醛纤维加入氢氧化钠-尿素溶液中，再加入去离子水和硅烷化树脂混合均匀，混合后的溶...
【专利技术属性】
技术研发人员：李道明，梅玲，彭伊凡，丁小刚，周端，蒲华寅，
申请(专利权)人：陕西科技大学，
类型：发明
国别省市：
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