本文所介绍的发明专利技术提供双色微阵列芯片测量系统中可靠测量荧光信号的方法和仪器。在双色荧光实验中使用两种荧光团标记样品时，所提供的方法和仪器可以使用户校正ＦＲＥＴ干扰和荧光串扰。此发明专利技术中包含校正的方法、计算校正所需系统因子的方法、配套荧光扫描仪和适用于校正过程的微阵列芯片。这些方法通过在Ｃｙ５与Ｃｙ３之间存在ＦＲＥＴ作用的微阵列芯片所证实。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
这项专利技术是关于一种用于双色荧光标记系统的测量荧光发射光的可靠方法和体系，以及一种用于双色荧光标记系统的校正荧光共振能量转移与荧光串扰的简单方法。
技术介绍
微阵列是一项普遍和有效的分子生物学研究技术，广泛用于基因表达谱分析、基因组分析和药物开发。在需要检测特定靶标分子(如DNA或RNA序列)的应用领域中，微阵列技术广为人知，同时在微阵列的制作和使用方法方面，已积累了许多的研究基础。微阵列芯片上的信息读取可以通过多种不同的方式，但最为便利并且选择性最高的方法是通过荧光检测，因为需要检测的靶标分子通常具有较低的荧光背景，而且荧光检测工具易于实现自动化。微阵列方法通过荧光强度分析，可以并行地分析样品中不同靶标分子(例如核酸和蛋白)的相对数量。典型的应用包括使用cDNA微阵列芯片进行表达谱分析(Duggan, e"丄,Nature Genetics Supplement, 21: 10-14， 1999; Yang， eta丄,Nature Review Genetics, 3: 579-588， 2002)。微阵列芯片上固定的探针通常是已知结构的分子，用以检测样品中能与探针结合的靶标分子数量。芯片上的某些特定探针分子与样品中的某些特定靶标分子具有较强的亲和力。如果这些靶标分子存在于样品中，它们将与探针结合，并固定在芯片上。那么基于微阵列芯片上的荧光强度分析，将可以同时检测样品中大量不同耙标分子的相对数量。使用微阵列技术时，可以选择两种方案单色方案和双色方案。单色方案中，只使用一种荧光团标记不同的样品分别标记后，与不同的芯片杂交。而双色方案中，使用两种荧光团(例如Cy3和Cy5)分别标记两个样品(处理样品和对照样品)。在单色方案中，通过荧光强度来测量单一样品中的靶标数量。在双色方案中，两个不同样品中相同耙标的相对数量可以同时测量，其前提是两种荧光团的测量互不干扰。双色微阵列芯片的制作流程中，首先通过在薄板、芯片或载玻片上点制探针分子(例如cDNA片段、寡核苷酸、蛋白或组织)制作微阵列。通常，尺寸适合于样品自动处理和商业化荧光扫描仪检测的载玻片或薄板用作刚性的基底。其表面经过修饰后，包覆了聚赖氨酸或氨基，用于固定不同类型的探针分子。两组不同的样品(处理样品和对照样品，或阳性对照和阴性对照)分别使用不同的荧光团标记(例如标记处理样品的Cy5和标记对照样品的Cy3)。将标记后的样品混合，与固定有可寻址探针的微阵列芯片进行亲和反应。之后，洗去未与芯片结合的荧光标记的靶标分子，使用荧光扫描仪的双通道分别读取两种荧光的强度。通过分析来自双通道的合成的微阵列图像，可以进行背景校正，计算和归一化每个探针点上荧光团的数量比率(如Cy5/Cy3)。通过数据的解释，获取定量的生物信息，并分析实验的置信度。然而，在双色微阵列系统中，两种荧光团之间可能会相互影响。当两种荧光团存在光谱重叠，并且同时存在于处理样品和对照样品的相同靶标结合到芯片上的同一探针区域时，两种荧光团之间可能发生非辐射的相互作用，例如FRET(称为荧光共振能量转移或福斯特共振能量转移)。由于FRET是一种距离依赖性的荧光团相互作用，因此当两种荧光距离较远时，不会发生FRET作用。但是实际情况下，很难确定两个荧光团之间的距离。同时，由于一种荧光团可能被另一种荧光团的激发光所激发，并且一种荧光团的发射荧光可能就进入另一种荧光团的检测通道，这被称作荧光串扰。FRET和荧光串扰的产生与荧光的光谱属性和检测仪器的配置有关。因此，在双标记实验中，荧光信号的采集将可能受到FRET和荧光串扰的干扰。当一种荧光团(受体)的激发光谱与另一种荧光团(配体)的发射光谱存在重叠，并且这两种荧光团之间的距离小于10mn时，这两个荧光团之间可能发生非辐射的FRET作用。配体(如Cy3)和受体(如Cy5)称为FRET荧光对。配体较受体具有更短的激发和发射波长，以及更高的能量。当FRET发生时，配体的测量信号不能准确反应配体的真实数量FRET将减少配体的直接荧光发射，而将配体的部分能量非辐射的转移给受体，从而干扰配体数量的测量。若同时检测受体荧光时，受体荧光的测量信号也将受到干扰，因为受体除了被激发光源激发外，还将接受因FRET作用从配体传递的能量。为了消除因FRET而带来的测量干扰，需要选择合适光谱属性的荧光团，或12者控制荧光团之间的距离超越FRET作用范围，例如使荧光团之间的距离大于10nm。但是，在一些实验系统中，不可能严格控制荧光团之间的距离，甚至在某些实验中，需要两种荧光团之间相互靠近。荧光串扰的发生通常是因为荧光团的激发和发射光谱与测量仪器激发和发射波长的重叠。例如，某些情况下，使用配体通道中的配体激发光可以激发受体，而受体的发射光可以进入到配体的检测通道(当受体的吸收光谱与配体通道的配体激发光存在重叠)。同样， 一些情况下，使用受体通道中的受体激发光可以激发配体，而配体的发射光可以进入到受体的检测通道中。在一个理想的微阵列芯片平台上(包含特定的荧光团和荧光扫描仪组合)，FRET和荧光串扰都应该得到避免，这样，测量得到的荧光强度将正比于芯片上荧光团的数目。然而双色微阵列平台上的常用荧光团满足FRET发生的光谱条件，同时，芯片上荧光团之间的距离难以控制，因此FRET或荧光串扰难以完全避免。当FRET存在时，需要对测量的配体荧光信号进行校正，达到通过荧光信号准确地确定荧光团数目的目的。过去的微阵列实验中，两种荧光团的强度分别通过荧光扫描仪的两个通道(通常为Cy3通道和Cy5通道)直接测量，没有进行FRET校正与荧光串扰校正。当两种荧光团(例如Cy3与Cy5)同时存在与芯片上的同一个探针点上时， 具有更高能量的荧光团(例如Cy3)可被看作配体。高能量的荧光团可以提供能量， 去激发低能量的荧光团；而低能量的荧光团却不能提供足够的能量去激发高能量的 荧光团。当芯片上的配体与受体发生FRET时，配体荧光信号将降低，因此部分的配 体能量将会通过非辐射途径传递给受体，而非以光子的形式进入荧光检测通道。而 只有配体发射波长的荧光光子才能够被配体通道的检测器接收，而受体发射波长的 荧光光子与配体非辐射的能量无法被配体通道的检测器接收，因此通过配体的荧光 强度将低估芯片上的配体数量。本专利技术提供了一种用于双色微阵列实验的可靠的利用三通道荧光扫描仪的 荧光强度测量方案。扫描仪的每个通道分别接收特定的荧光发射信号，整合三个通 道的荧光信号可以进行FRET校正与荧光串扰校正。这种可靠的荧光测量方法可以 准确测量微阵列芯片上的荧光强度，为后续的微阵列分析提供可靠的数据。配体通道指使用配体激发波长激发，通过配体发射波长检测；受体通道指 使用受体激发波长激发，通过受体发射波长检测；FRET通道指使用配体激发波长激 发，通过受体发射波长检测
技术实现思路
总论此专利技术提供了包含FRET校正和荧光串扰校正的可靠荧光测量的技术和设 备。我们首先描述FRET校正方案，然后考虑荧光串扰的校正。主要包含三个步骤a) 确定实验系统参数(包含特定的荧光团、荧光扫描仪及扫描参数的组合)b) 获取配体通道荧光发射、受体通道荧光发射和FRET通道荧光发射。其中配 体通道用于观察配体荧光，受体通道用于观察受体荧光，FRET通道用于观察本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于双色荧光测量系统的微阵列芯片，包含用于确定荧光测量校正因子的三种标准探针点，即： 标准探针点１，仅含配体，而不含受体； 标准探针点２，仅含受体，而不含配体，其数量与标准探针点１上的配体数量相同； 标准探针点３，含有等数量的配体与受体。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
【专利技术属性】
技术研发人员：朱疆，邓橙，黄国亮，徐书宽，程京，
申请(专利权)人：博奥生物有限公司，清华大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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