【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体公开了一种牛乳抗菌肽、制备方法及其应用。
技术介绍
1、抗菌肽是一类天然产生的小分子肽段，作为一种新型的抗生素具有广谱的抗菌活性且不会轻易使微生物产生耐药性，在医药、食品、化妆品等领域有着广泛的应用前景。抗菌肽来源于蛋白质，在自然界中广泛分布，随着越来越多的抗菌肽在微生物、动植物体内被发现，规模化制备抗菌肽成为抗菌肽应用的实际需求。
2、现有的抗菌肽制备技术主要为人工合成和生物表达两种技术路线。人工合成是通过化学合成的方法合成目标肽段。通过设计和合成具有特定序列和活性的抗菌肽，但制备成本较高，适用于小规模研究和临床应用，且人工合成的阳离子抗菌肽可能对哺乳动物的细胞产生较大的毒性作用。生物表达是利用细菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞等体内表达体外表达方法。通过基因工程技术将抗菌肽的基因导入到宿主细胞内，使其能够产生抗菌肽。具体的过程包括基因克隆、转染或转化、培养优化、蛋白表达及纯化等步骤。生物表达法能够大规模产生较高活性的抗菌肽，但在纯化过程中需要复杂的多层工序。因此，开发安全、稳定、低细胞毒性的抗菌肽具有重要意义。
3、牛乳作为新型食品原料具有安全性高和适应性广泛等优势。牛乳作为一种普遍受欢迎的食品，有丰富的蛋白质和多肽资源，其质量和安全性长期以来得到了高度关注和监管，这确保了牛乳作为食品原料的高品质和安全性，兼顾了抗菌肽的优势及优质安全的蛋白来源两个特质。乳酸菌产生的酶对蛋白质有较强的水解作用，能将牛乳中的蛋白质分解成具有多种生物活性的肽，提高牛乳蛋白质的利用价值。在卫生部公开的
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有显著抑制作用的牛乳抗菌肽的制备方法及应用，本专利技术通过微生物发酵法将乳蛋白质降解，分离纯化其中的抗菌肽组分，所制备的牛乳抗菌肽在制备预防和/或降低由大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、疮疱丙酸杆菌、铜绿假单胞菌、牙龈卟啉单胞菌和变异链球菌引起的感染疾病药物和/或保健品或者应用于新型食品、护肤品中可作食品保鲜剂、口腔抑菌剂、防腐剂等。
2、所述牛乳抗菌肽的制备方法，包括以下步骤：
3、(1)培养基制备及发酵培养
4、配制乳蛋白质含量为5％～20％的脱脂奶粉水溶液为发酵培养基，充分混合均匀后110℃灭菌15min。以2％接种量接菌，发酵液中菌含量为2×10^5～5×10^8cfu/ml，于200rpm、30～60℃发酵10～60h。121℃灭菌20min使菌种灭活，结束发酵。
5、(2)抗菌肽纯化
6、发酵液于3000～8000转/分钟、4℃条件下离心20min，去除发酵液中的杂质及不溶性物质，保留离心后上清液。发酵上清液用纯水稀释至3-8倍体积，经截留分子量为3～30kda超滤膜分离，收集超滤液。发酵超滤液再经截留分子量<1k da的纳滤膜分离，浓缩至发酵液初始体积，收集纳滤截留液。
7、(3)收集纳滤截留液干燥得到牛乳抗菌肽。-20℃冷冻保存。
8、本专利技术所述方法是以乳蛋白为原料，通过微生物发酵法以及多级膜分离纯化工艺制备牛乳抗菌肽，利用本方法制备牛乳抗菌肽的收率可达10～30％，产物中肽含量为60～85％。
9、本专利技术与现有技术相比，具有如下有益效果：
10、1.依据本方法所制备的牛乳抗菌肽具有很好的微生物生长抑制活性，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌均有显著的抑制作用。其中对大肠杆菌(escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、疮疱丙酸杆菌(propionibacterium acnes)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、牙龈卟啉单胞菌(porphyromonas gingivalis)和变异链球菌(streptococcus mutans)的ic50值均低于40mg/ml。溶解性好，纯度高，是一种绿色、安全、高效的广谱性抗菌肽。
11、2.本专利技术公开了一种牛乳抗菌肽及其制备方法，其方法包括乳蛋白发酵和抗菌肽的收集纯化。方法简便可行，反应条件温和。
12、3.本专利技术利用可食用益生菌发酵乳蛋白生产制备抗菌肽，与其他菌种相比，该专利技术具有成本低、绿色、安全等优势。所用菌种均属于卫生部公开的可用于食品的益生菌菌种名单中，可广泛应用于乳品发酵中，菌种培养成本低，发酵过程易于控制，适合应用到规模化制备中。
13、4.具有良好的应用前景。依照本专利技术所述方法制备的牛乳抗菌肽，原料及产物绿色安全，食用更方便，易被人体吸收，因此作为食品、药品、功能食品具有广泛的应用前景。可作为预防和/或降低由微生物引起的感染疾病的药物和/或保健品或者用于新型食品、护肤品中可作食品保鲜剂、口腔抑菌剂、防腐剂等。
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1.一种发酵法制备牛乳抗菌肽的方法，其特征在于：经过发酵、离心、超滤分离、纳滤浓缩和干燥，最终得到牛乳抗菌肽；
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于：所使用的菌种为保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、副干酪乳杆菌、瑞士乳杆菌和短双歧杆菌其中的一种或者两种以上组合。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的超滤膜截留分子量为3～30k Da。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(4)中的纳滤膜截留分子量≤1kDa。
5.一种权利要求1-4任一所述方法发酵法制备的牛乳抗菌肽。
6.一种权利要求5所述的抗菌肽的应用，其特征在于，其用于细菌生长抑制剂或杀菌剂，所述抗菌肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、疮疱丙酸杆菌、铜绿假单胞菌、牙龈卟啉单胞菌和变异链球菌中的一种或者两种以上有生长抑制活性。
7.一种权利要求5所述的牛乳抗菌肽在制备预防和/或降低由大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、疮疱丙酸杆菌、铜绿假单胞菌、牙龈卟啉单胞菌和变异链球菌中的一种或者两种以上引起的感染疾病药物和/或保健品、或护肤品中，或也可作
8.按照权利要求7所述的应用，其特征在于：所述抗感染药物是以该牛乳抗菌肽为活性成份，其中可添加药物学上可接受的载体或辅料。
...【技术特征摘要】
1.一种发酵法制备牛乳抗菌肽的方法，其特征在于：经过发酵、离心、超滤分离、纳滤浓缩和干燥，最终得到牛乳抗菌肽；
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于：所使用的菌种为保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、副干酪乳杆菌、瑞士乳杆菌和短双歧杆菌其中的一种或者两种以上组合。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的超滤膜截留分子量为3～30k da。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(4)中的纳滤膜截留分子量≤1kda。
5.一种权利要求1-4任一所述方法发酵法制备的牛乳抗菌肽。
6.一种权利要求5所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：靳艳，于文皓，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：
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