【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及种属鉴定，特别是涉及一种基于线粒体基因用于同时鉴别12种动物源性成分的引物组、试剂盒和检测方法。
技术介绍
1、种属鉴定指的是对生物检材(如体液、分泌物、毛发、肌肉、骨骼等)的种属来源鉴定，即确定检材是人体所有，还是某种动物所有。种属鉴定除了用于分析鉴定案发现场遗留生物检材，为案件侦查及现场重建提供重要线索外，在食品安全领域也发挥着重要的作用，由于不同肉类价格差异带来的经济效益诱惑，不法分子会将猪肉、鸡肉、鸭肉等廉价肉类，甚至是不可食用肉类(老鼠肉等)来替代牛肉、羊肉、驴肉等高价肉类进行售卖。肉类掺假不仅破坏市场秩序，导致经济损失，还可能影响消费者的健康，甚至引发民族和宗教冲突。因此，对未知生物检材进行种属鉴定是法医工作者的重要任务，也是法庭科学领域亟待解决的基本问题。
2、dna作为生物体的主要遗传物质，具有较好的结构稳定性及物种特异性的遗传信息。其中，线粒体dna(mitochondrial dna,mtdna)相较于核dna，因具有拷贝数多、突变率高、稳定性好、重组率低等特点，已成为种属鉴定的理想分子标记。目前，使用mtdna基因通用引物扩增结合sanger测序是种属鉴定的常规方法，但当遇到来自多个物种的dna混合物时，会产生难以解释的混合dna图谱。此外，降解样本也常常无法提供足够多的序列信息进行比对。近年来，基于mtdna基因扩增的物种特异性pcr受到了广泛关注，该方法包括使用一对以上的物种特异性引物扩增mtdna基因的不同片段，然后进行琼脂糖凝胶电泳。与常规pcr相比，物种特异性引物的多重p
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种基于线粒体基因用于同时鉴别12种动物源性成分的引物组、试剂盒和检测方法，以解决上述现有技术存在的问题。本专利技术基于线粒体基因构建了能够同时扩增和鉴定12种动物源性成分的引物组、试剂盒和检测方法，为法医学和动物类食品鉴定提供一种可靠、便捷的检测手段，对常见动物山羊、牛、驴、鸡、狗、猪、马、绵羊、鹅、鼠、鸭和猫的快速鉴别具有重要意义。
2、为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
3、本专利技术提供一种基于线粒体基因同时鉴别12种动物源性成分的引物组，所述引物组包括：
4、扩增山羊d-loop基因的引物对，包括如seq id no.1-2所示的上游引物和下游引物；
5、扩增牛16s rrna基因的引物对，包括如seq id no.3-4所示的上游引物和下游引物；
6、扩增驴nadh2基因的引物对，包括如seq id no.5-6所示的上游引物和下游引物；
7、扩增鸡cytb基因的引物对，包括如seq id no.7-8所示的上游引物和下游引物；
8、扩增狗atp8基因的引物对，包括如seq id no.9-10所示的上游引物和下游引物；
9、扩增猪coxi基因的引物对，包括如seq id no.11-12所示的上游引物和下游引物；
10、扩增马atp6基因的引物对，包括如seq id no.13-14所示的上游引物和下游引物；
11、扩增绵羊nadh4基因的引物对，包括如seq id no.15-16所示的上游引物和下游引物；
12、扩增鹅16s rrna基因的引物对，包括如seq id no.17-18所示的上游引物和下游引物；
13、扩增鼠nadh4基因的引物对，包括如seq id no.19-20所示的上游引物和下游引物；
14、扩增鸭nadh6基因的引物对，包括如seq id no.21-22所示的上游引物和下游引物；
15、扩增猫nadh2基因的引物对，包括如seq id no.23-24所示的上游引物和下游引物。
16、进一步地，所述引物组中的上游引物均标记有荧光染料。
17、进一步地，扩增所述山羊d-loop基因、所述牛16s rrna基因、所述驴nadh2基因、所述鸡cytb基因、所述狗atp8基因和所述猪coxi基因的上游引物均标记有fam荧光染料；扩增所述马atp6基因、所述绵羊nadh4基因、所述鹅16s rrna基因、所述鼠nadh4基因、所述鸭nadh6基因和所述猫nadh2基因的上游引物均标记有hex荧光染料。
18、本专利技术还提供上述引物组在制备同时鉴定12种动物源性成分的试剂盒中的应用。
19、本专利技术还提供一种同时鉴定12种动物源性成分的试剂盒，包含上述引物组。
20、可选的，所述试剂盒中还包含2×multiplex pcr master mix、5×q-solution和水。
21、本专利技术还提供一种对12种动物源性成分进行种属鉴定的方法，包括如下步骤：
22、(1)提取待测样本的dna；
23、(2)采用上述试剂盒对所述dna进行多重pcr扩增，得到扩增产物；
24、(3)对所述扩增产物进行分型检测，根据检测结果确定所述待测样本的种属来源。
25、可选的，所述多重pcr扩增的反应体系为：2×multiplex pcr master mix 7.5μl、5×q-solution 1.5μl、引物混合物1μl、dna 1μl，水补至15μl。
26、可选的，所述反应体系中，扩增山羊d-loop基因的引物对的终浓度为0.26μm；扩增牛16s rrna基因的引物对的终浓度为0.5μm；扩增驴nadh2基因的引物对的终浓度为3μm；扩增鸡cytb基因的引物对的终浓度为0.4μm；扩增狗atp8基因的引物对的终浓度为0.6μm；扩增猪coxi基因的引物对的终浓度为0.3μm；扩增马atp6基因的引物对的终浓度为1.6μm；扩增绵羊nadh4基因的引物对的终浓度为0.3μm；扩增鹅16s rrna基因的引物对的终浓度为0.3μm；扩增鼠nadh4基因的引物对的终浓度为0.3μm；扩增鸭nadh6基因的引物对的终浓度为0.3μm；扩增猫nadh2基因的引物对的终浓度为1.3μm。
27、可选的，所述多重pcr扩增的反应程序为：95℃预变性15min；94℃变性30s，58℃退火90s，72℃延伸90s，共30次循环；60℃终延伸60min；4℃保温。
28、可选的，所述分型检测前，还包括将所述扩增产物与分子量内标、甲酰胺混合的步骤；进一步可选的，所述扩增产物、分子量内标和甲酰胺的体积比为1：0.本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于线粒体基因同时鉴别12种动物源性成分的引物组，其特征在于，所述引物组包括：
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物组中的上游引物均标记有荧光染料。
3.根据权利要求2所述的引物组，其特征在于，扩增所述山羊D-LOOP基因、所述牛16SrRNA基因、所述驴NADH2基因、所述鸡CYTB基因、所述狗ATP8基因和所述猪COXI基因的上游引物均标记有FAM荧光染料；扩增所述马ATP6基因、所述绵羊NADH4基因、所述鹅16S rRNA基因、所述鼠NADH4基因、所述鸭NADH6基因和所述猫NADH2基因的上游引物均标记有HEX荧光染料。
4.权利要求1-3任一项所述的引物组在制备同时鉴定12种动物源性成分的试剂盒中的应用。
5.一种同时鉴定12种动物源性成分的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-3任一项所述的引物组。
6.一种对12种动物源性成分进行种属鉴定的方法，其特征在于，包括如下步骤：
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述多重PCR扩增的反应体系为：2×Multiple
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述反应体系中，扩增山羊D-LOOP基因的引物对的终浓度为0.26μM；扩增牛16S rRNA基因的引物对的终浓度为0.5μM；扩增驴NADH2基因的引物对的终浓度为3μM；扩增鸡CYTB基因的引物对的终浓度为0.4μM；扩增狗ATP8基因的引物对的终浓度为0.6μM；扩增猪COXI基因的引物对的终浓度为0.3μM；扩增马ATP6基因的引物对的终浓度为1.6μM；扩增绵羊NADH4基因的引物对的终浓度为0.3μM；扩增鹅16SrRNA基因的引物对的终浓度为0.3μM；扩增鼠NADH4基因的引物对的终浓度为0.3μM；扩增鸭NADH6基因的引物对的终浓度为0.3μM；扩增猫NADH2基因的引物对的终浓度为1.3μM。
9.根据权利要求6所述的方法，所述多重PCR扩增的反应程序为：95℃预变性15min；94℃变性30s，58℃退火90s，72℃延伸90s，共30次循环；60℃终延伸60min；4℃保温。
10.一种权利要求1-3任一项所述的引物组、权利要求5所述的试剂盒或权利要求6-9任一项所述的方法在法医学动物源性检材种属鉴定或肉类掺假检测中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种基于线粒体基因同时鉴别12种动物源性成分的引物组，其特征在于，所述引物组包括：
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物组中的上游引物均标记有荧光染料。
3.根据权利要求2所述的引物组，其特征在于，扩增所述山羊d-loop基因、所述牛16srrna基因、所述驴nadh2基因、所述鸡cytb基因、所述狗atp8基因和所述猪coxi基因的上游引物均标记有fam荧光染料；扩增所述马atp6基因、所述绵羊nadh4基因、所述鹅16s rrna基因、所述鼠nadh4基因、所述鸭nadh6基因和所述猫nadh2基因的上游引物均标记有hex荧光染料。
4.权利要求1-3任一项所述的引物组在制备同时鉴定12种动物源性成分的试剂盒中的应用。
5.一种同时鉴定12种动物源性成分的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-3任一项所述的引物组。
6.一种对12种动物源性成分进行种属鉴定的方法，其特征在于，包括如下步骤：
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述多重pcr扩增的反应体系为：2×multiplex pcr master mix 7.5μl、5×q-solution 1.5μl、引物混合...
【专利技术属性】
技术研发人员：夏若成，何晓丹，马开军，陶瑞旸，刘希玲，朱如心，林源，赵珍敏，陈航，
申请(专利权)人：司法鉴定科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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