【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于酶工程和微生物工程，涉及了氨基酸序列如序列表中seq idno.3所示的檀香烯合酶(sansyn)的突变体，以及其重组表达细胞在生物法制备不同构型比例的檀香烯中的应用，涉及编码所述酶的核酸序列、包含所述编码核酸序列的重组表达载体及用于制备檀香烯的方法。
技术介绍
1、倍半萜类化合物是由3个类异戊二烯单位组成的15碳的化合物，属于萜类家族中的一种，其大多具有较强的香气和生物活性，广泛应用于食品、化妆品、医药行业。檀香烯(santalene)和檀香醇(santalol)都属于倍半萜类化合物，檀香烯是檀香醇合成的前体物质，二者是檀香精油的主要组成成分。檀香精油具有宜人且持久的芳香，是世界上最受欢迎的天然香料之一，其广泛应用于化妆品行业和食品行业。此外檀香精油还具有许多有健康益处的药理活性，如抗氧化、抗细菌、抗病毒、抗癌活性等，具有重大的经济价值。目前檀香精油主要依靠从檀香树的心材和根中通过水蒸气蒸馏提取获得，但檀香树需要经过30年的生长才能提取檀香精油，且成熟年龄的檀香树的檀香精油提取率也仅在2.5％-6％之间，远远不能满足人们对檀香制品日益增长的的市场需求。通过化学合成法合成檀香烯檀香醇工艺复杂，反应条件苛刻，成本高，产品纯度低，天然檀香精油价格仍居高不下。相较于传统的植物提取法和化学合成法，通过构建微生物细胞工厂进行生物合成的方法为倍半萜绿色高效低成本的工业生产提供了可能。
2、至今为止已从檀香精油中鉴定出200多种成分，主要由倍半萜类化合物组成，如(z)-α-santalol、(z)-β-santalo
3、如前所述，檀香精油的组成比例决定了檀香精油的风味和品质，而合理控制产物比例是构建檀香精油异源生物合成体系的难点。在檀香精油主要成分檀香醇在酿酒酵母的生物合成途径中，檀香烯合酶(santalene synthase)不仅是该途径的限速酶，也是决定檀香醇构型比例的关键酶，由烯到醇的催化酶cyp450(cytochrome p450 monooxygenase)对不同构型的底物表现出类似偏好。目前长用的两种檀香烯合酶是来源于clausena lansium的sansyn酶和来源于s.album的sassy酶。sassy是产品混杂型酶，其产物包含四种不同构型的檀香醇，zha等人在酿酒酵母内引入sassy酶和cyp450/cpr，其产物檀香醇的α和β构型比例分别为35.7±1.1％，17.8±0.8％，檀香醇构型比例达不到iso标准。与产品混杂的sassy酶不同，sansyn是一种产物构型α专一性的檀香烯合酶，其使用(e,e)-fpp为底物，产物主要为α-santalene，同时伴随着微量的α-bergamotene。zha等人提出sansyn活性口袋缺乏未占空间，这是其中间构象被限制，产物α-专一性的关键因素，在酿酒酵母中引入突变体sansynf411v，产物檀香烯的α和β构型比例为57.2％，28.6％，进一步导入cyp450后产物α和β构型比例为43.4％，22％，符合iso标准，但突变后酶的活性大幅降低。此外，styles等人报来源于cinnamomumcamphora的cicassy酶经n267s/n267l突变后檀香烯产物β构型大于α构型，但产量未见其报道。
4、酶工程已经被证明是优化酶性能的有效方法，我们通过对酶的分子改造从而改造产物檀香烯的构型比例，最终获得酿酒酵母生产檀香烯产物比例理想的菌株，以满足未来大规模生物合成檀香精油的需求。
技术实现思路
1、为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的目的在于提供一种檀香烯合酶突变体。
2、本专利技术的另一目的在于提供上述檀香烯合酶突变体在制备檀香烯中的应用。
3、本专利技术所要解决的技术问题是针对檀香烯合酶作为生物合成檀香烯檀香醇的关键酶以及决定檀香醇构型比例的关键酶，但其产物构型比例单一这一现状，提供一系列产物比例的具有较好催化活性的檀香烯合酶突变体。
4、产物构型比例符合iso标准的酶使产物更接近天然檀香精油成分，此外，对β-檀香烯具有更高专一性的酶是可取的，因为β-檀香醇气味浓郁厚重，被认为赋予了檀香木最重要的气味，在工业化生产中能够根据特定需要来控制檀香烯合酶的两种主要产品的产物比例是较为理想的。
5、本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
6、一种檀香烯合酶(santalene synthase)突变体，所述檀香烯合酶突变体的氨基酸序列如seq id no.3所示，其中，seq id no.3中至少一个标注为“x”的位点与seq id no.2的相应位点的氨基酸残基突变。
7、所述檀香烯合酶(santalene synthase)来源于植物黄皮(clausena lansium)，其氨基酸序列的genbank号为adr71055.1，其编码基因的genbank号为hq452480.1。
8、本专利技术中，所述檀香烯合酶为sansyn，其经密码子优化后的核苷酸序列如seq idno.1所示，共包含1656个核苷酸；其氨基酸序列如seq id no.2所示，共包含551个氨基酸。在sansyn基础上进行进一步改造。
9、已经特别的发现在seq id no.2的以下位置进行突变有利于获得产物比例改变的突变体：269、273、402、460、503、514、529。在一个优选实施方案中，与seq id no.2相比，已经用选自以下一个位点的sansyn实现了良好结果：269、273、402、460、503、514、529。要指出的是，原则上对sansyn突变氨基酸残基的数目不存在限制，条件是该酶保留作为檀香烯合酶足够的催化性能。
10、优选的，檀香烯合酶突变体为sansyn_l269a、sansyn_i273s、sansyn_i402c、sansyn_p460s、sansyn_p460a、sansyn_p460t、sansyn_i503a、sansyn_l514c、sansyn_f529v。
11、更优选的，檀香烯合酶突变体为sansyn_i402c，即第402位异亮氨酸突变为半胱氨酸的突变体i402c，氨基酸序列为seq id no.4所示；核苷酸序列为seq本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.檀香烯合酶SanSyn突变体，其特征在于：所述檀香烯合酶SanSyn突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，其中，SEQ ID No.3中至少一个标注为“X”的位点与SEQ ID No.2的相应位点的氨基酸残基突变。
2.根据权利要求1所述的檀香烯合酶SanSyn突变体，其特征在于：
3.编码权利要求1～2任一项所述的檀香烯合酶SanSyn突变体的基因。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于：编码突变体SanSyn_I402C的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，编码突变体SanSyn_P460A的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示,编码突变体SanSyn_P460S的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。
5.权利要求1～2任一项所述的檀香烯合酶SanSyn突变体相关的生物材料，其特征在于：为下述生物材料中的任意一种或多种组合：
6.根据权利要求5所述的生物材料，其特征在于：
7.根据权利要求5或6所述的生物材料，其特征在于：
8.根据权利要求7所述的
9.权利要求1～2任一项所述的檀香烯合酶SanSyn突变体、权利要求3～4任一项所述基因或权利要求5～8任一项所述的生物材料在合成檀香烯中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：在生物合成檀香烯中的应用。
...【技术特征摘要】
1.檀香烯合酶sansyn突变体，其特征在于：所述檀香烯合酶sansyn突变体的氨基酸序列如seq id no.3所示，其中，seq id no.3中至少一个标注为“x”的位点与seq id no.2的相应位点的氨基酸残基突变。
2.根据权利要求1所述的檀香烯合酶sansyn突变体，其特征在于：
3.编码权利要求1～2任一项所述的檀香烯合酶sansyn突变体的基因。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于：编码突变体sansyn_i402c的基因的核苷酸序列如seq id no.5所示，编码突变体sansyn_p460a的基因的核苷酸序列如seq id no.7所示,编码突变体sans...
【专利技术属性】
技术研发人员：李爽，李伟强，朱晁谊，陈东莹，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：
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