【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及鸡球虫检测，特别是涉及基于raa-crispr/cas12a技术7重检测鸡球虫的引物、试剂盒及检测方法。
技术介绍
1、鸡球虫病是由一种或几种艾美耳属球虫混合感染而引起的鸡寄生性原虫病，给全球鸡养殖业造成巨大经济损失。目前全世界公认的鸡球虫共有7种，分别是堆型艾美耳球虫(eimeria acervulina)、柔嫩艾美耳球虫(eimeria tenella)、巨型艾美耳球虫(eimeriamaxima)、毒害艾美耳球虫(eimeria necatrix)、和缓艾美耳球虫(eimeria mitis)、早熟艾美耳球虫(eimeria precocious)和布氏艾美耳球虫(eimeria brunetti)。在自然情况下，鸡球虫往往以2种或2种以上混合感染，每种艾美球虫均具有部位和宿主特异性，并引起不同程度的肠道疾病。鸡球虫种的准确鉴定对球虫病的诊断和防治具有重要意义。
2、目前，鸡球虫种类鉴定的传统经典方法是以卵囊的形态大小、潜隐期、寄生肠段、肠道病变等特征为鉴别指标。但是该方法需要经过单卵囊纯化球虫、扩繁、寄生部位和损伤部位观察测定等步骤，需要约1个月以上，主要依靠人肉眼识别，不仅工作量大而且受工作人员的经验及专业程度影响较大。传统的鸡球虫种类鉴定方法主要基于病原生物学特征，在具体实施中操作繁琐，费时费力。近年来，基因编辑技术发展迅速，基于cas12a的切割特性，将pcr技术和rpa技术与crispr/cas12a、荧光探针技术结合，有助于病原可视化检测技术的发展。因此，在鸡球虫临床诊断和疫苗生产中急
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供基于raa-crispr/cas12a技术7重检测鸡球虫的引物、试剂盒及检测方法，以解决上述现有技术存在的问题。
2、为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
3、本专利技术提供基于raa-crispr/cas12a技术7重检测鸡球虫的raa引物，所述引物包括如seq id no.10所示的上游引物f3和如seq id no.12所示的下游引物r2；
4、所述鸡球虫包括堆型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫、早熟艾美耳球虫和布氏艾美耳球虫。
5、本专利技术还提供上述raa引物在制备基于raa-crispr/cas12a技术7重检测鸡球虫的试剂盒中的应用。
6、本专利技术还提供一种基于raa-crispr/cas12a技术7重检测鸡球虫的试剂盒，所述试剂盒包括上述raa引物、crrna、cas12a蛋白和ssdna；
7、所述鸡球虫包括堆型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫、早熟艾美耳球虫和布氏艾美耳球虫中的任意一种。
8、优选地，当所述鸡球虫为柔嫩艾美耳球虫时，所述crrna的核苷酸序列如seq idno.14所示；当所述鸡球虫为巨型艾美耳球虫时，所述crrna的核苷酸序列如seq id no.15所示；当所述鸡球虫为堆型艾美耳球虫时，所述crrna的核苷酸序列如seq id no.16所示；当所述鸡球虫为毒害艾美耳球虫时，所述crrna的核苷酸序列如seq idno.17所示；当所述鸡球虫为和缓艾美耳球虫时，所述crrna的核苷酸序列如seq id no.18所示；当所述鸡球虫为早熟艾美耳球虫时，所述crrna的核苷酸序列如seq id no.19所示；当所述鸡球虫为布氏艾美耳球虫时，所述crrna的核苷酸序列如seq id no.20所示。
9、优选地，所述ssdna的核苷酸序列为5'-fam-ttatt-bhqi-3'。
10、优选地，所述试剂盒中还包括a bufer、b bufeer、ddh2o、10×nebuffer 2.1和rnase-free h2o。
11、本专利技术还提供一种非疾病诊断和/或治疗目的的鸡球虫7重检测方法，包括如下步骤：
12、(1)提取待测粪便样本中的鸡球虫卵囊dna模板；
13、(2)采用上述试剂盒中的raa引物，以鸡球虫卵囊dna为模板，进行raa扩增反应，得到扩增产物；
14、(3)以所述扩增产物为模板，采用上述试剂盒进行crispr/cas12a反应，得到反应产物；若所述反应产物呈现绿色荧光，则判定待测粪便样本中含有crrna对应类型的鸡球虫，或，若所述反应产物的荧光值≥1390，则判定待测粪便样本中含有crrna对应类型的鸡球虫。
15、优选地，所述raa扩增反应的反应体系包括：12.5μlabufer，1μl 10μmol/l上游引物f3，1μl 10μmol/l下游引物r2，1μl模板，1.25μlb bufer，8.25μl ddh2o；
16、所述raa扩增反应的温度为40℃，时间为30min。
17、优选地，所述crispr/cas12a反应的反应体系包括：2.5μl 10×nebuffer 2.1，2μl扩增产物，1μl 1μmol/l crrna，2.0-4.0μl 1μmol/l cas12a蛋白，2.0-4.0μl 10μmol/lssdna，rnase-free h2o补至20μl；
18、所述crispr/cas12a反应的温度为37℃，时间为60min。
19、优选地，所述crispr/cas12a反应的反应体系中，当所述crrna为seq id no.14、seq id no.16或seq id no.18时，cas12a蛋白的体积为2.0μl，ssdna的体积为2.0μl；
20、当所述crrna为seq id no.15、seq id no.17或seq id no.20时，cas12a蛋白的体积为3.0μl，ssdna的体积为2.0μl；
21、当所述crrna为seq id no.19时，cas12a蛋白的体积为4.0μl，ssdna的体积为4.0μl。
22、本专利技术公开了以下技术效果：
23、本专利技术针对堆型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫、早熟艾美耳球虫和布氏艾美耳球虫设计了一对通用的raa扩增引物，通过多重raa扩增体系扩增得到目标片段，可用于后续crispr/cas12a反应，然后利用本专利技术设计的特异性crrna，可区分判断7种鸡球虫，实现多种鸡球虫的即时检测和可视化检测。
24、本专利技术的检测方法，针对堆型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫、早熟艾美耳球虫的灵敏度可达1个球虫卵囊/μl，布氏艾美耳球虫的灵敏度可达1个拷贝/μl的质粒dna，即1个球虫卵囊/μl，对大肠杆菌、沙门氏本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.基于RAA-CRISPR/Cas12a技术7重检测鸡球虫的RAA引物，其特征在于，所述引物包括如SEQ ID NO.10所示的上游引物F3和如SEQ ID NO.12所示的下游引物R2；
2.权利要求1所述的RAA引物在制备基于RAA-CRISPR/Cas12a技术7重检测鸡球虫的试剂盒中的应用。
3.一种基于RAA-CRISPR/Cas12a技术7重检测鸡球虫的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的RAA引物、crRNA、Cas12a蛋白和ssDNA；
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，当所述鸡球虫为柔嫩艾美耳球虫时，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；当所述鸡球虫为巨型艾美耳球虫时，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；当所述鸡球虫为堆型艾美耳球虫时，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；当所述鸡球虫为毒害艾美耳球虫时，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；当所述鸡球虫为和缓艾美耳球虫时，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述ssDNA的核苷酸序列为5'-FAM-TTATT-BHQI-3'。
6.根据权利要求3-5任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括ABufer、BBufeer、ddH2O、10×NEBuffer 2.1和RNase-free H2O。
7.一种非疾病诊断和/或治疗目的的鸡球虫7重检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述RAA扩增反应的反应体系包括：12.5μLABufer，1μL 10μmol/L上游引物F3，1μL 10μmol/L下游引物R2，1μL模板，1.25μLBBufer，8.25μL ddH2O；
9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas12a反应的反应体系包括：2.5μL 10×NEBuffer 2.1，2μL扩增产物，1μL 1μmol/L crRNA，2.0-4.0μL 1μmol/LCas12a蛋白，2.0-4.0μL 10μmol/L ssDNA，RNase-free H2O补至20μL；
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas12a反应的反应体系中，当所述crRNA为SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16或SEQ ID NO.18时，Cas12a蛋白的体积为2.0μL，ssDNA的体积为2.0μL；
...【技术特征摘要】
1.基于raa-crispr/cas12a技术7重检测鸡球虫的raa引物，其特征在于，所述引物包括如seq id no.10所示的上游引物f3和如seq id no.12所示的下游引物r2；
2.权利要求1所述的raa引物在制备基于raa-crispr/cas12a技术7重检测鸡球虫的试剂盒中的应用。
3.一种基于raa-crispr/cas12a技术7重检测鸡球虫的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的raa引物、crrna、cas12a蛋白和ssdna；
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，当所述鸡球虫为柔嫩艾美耳球虫时，所述crrna的核苷酸序列如seq id no.14所示；当所述鸡球虫为巨型艾美耳球虫时，所述crrna的核苷酸序列如seq id no.15所示；当所述鸡球虫为堆型艾美耳球虫时，所述crrna的核苷酸序列如seq id no.16所示；当所述鸡球虫为毒害艾美耳球虫时，所述crrna的核苷酸序列如seq id no.17所示；当所述鸡球虫为和缓艾美耳球虫时，所述crrna的核苷酸序列如seq id no.18所示；当所述鸡球虫为早熟艾美耳球虫时，所述crrna的核苷酸序列如seqid no.19所示；当所述鸡球虫为布氏艾美耳球虫时，所述crrna的核苷酸序列如seq idno.20所示。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑明学，郭露露，杨雨彤，王黎雯，张学奇，
申请(专利权)人：山西农业大学，
类型：发明
国别省市：
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