【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，具体地，涉及一种快速提取酵母基因组dna的方法及应用。
技术介绍
1、酵母在基因工程
中应用广泛，其核心用途涵盖外源蛋白质的高效表达、代谢途径的精细调控以及合成生物学的创新实践。其中，毕赤酵母、酿酒酵母和乳酸克鲁维酵母是最常用的酵母菌株，它们在学术研究和工业生产中均受到了大量的关注与研究。例如，技术人员可通过基因工程手段对酵母细胞进行改造，使其生产生物燃料、有机酸等化学品，此外，酵母还可以用于生产乙肝疫苗，双价hpv疫苗等，应用在人体免疫及动物健康保护上。此外，酵母菌因其基因组小、遗传背景清晰，操作灵活等特点，常被用于基因编辑研究。通过crispr-cas9等技术，酵母已成为探索基因功能和疾病机制的重要载体。
2、研究表明，酵母菌细胞壁的厚度在25～70nm之间，通常占细胞干重的18％～25％。此外，酵母细胞壁成分复杂，其结构呈“三明治”状排列，最外层为甘露聚糖，内层为葡聚糖，在内外层之间夹有一层蛋白质分子，这些蛋白质分子大多以各种形式的酶蛋白存在，如葡聚糖酶，蔗糖酶，碱性磷酸酶等。正是因为酵母坚韧的细胞壁，给后续的提取酵母基因组dna，并进行pcr检测带来了很大的阻碍，从而大大的影响了对酵母细胞进行改造的鉴定与筛选工作。
3、目前常用的获取酵母基因组dna的方法主要有直接法、煮沸法、酶法、玻璃珠研磨法、超声波法等，不过这些方法均存在一定缺陷。要么是稳定性差，有效模板浓度低，要么是操作步骤繁琐，一次性提取模板量少。例如，直接法基因组dna的模板释放过程主要依靠pcr预变性和变
4、为了解决上述提取酵母基因组dna所遇到的问题，有必要专利技术一种简便、快速制备酵母基因组dna的方法，来满足以pcr技术为主要手段的酵母基因工程操作的需求。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是针对现有技术的不足，提供一种快速制备酵母基因组dna的方法，从而解决现有提取酵母基因dna操作步骤繁琐、使用有毒试剂、成本高、稳定性差、不适合大量制备等关键问题。
2、为了实现上述目的，本专利技术提供一种提取酵母基因组dna的方法，所述方法包括以下步骤：
3、(1)向96孔板(a)中分装溶液ⅰ，直接挑取生长时长为2～3d的酵母单菌落加入溶液ⅰ中，混匀；所述溶液ⅰ为10～20mmol/l pbs，ph为7.0～7.5；
4、(2)向96孔板(b)中分装溶液ⅱ，吸取96孔板(a)中的悬浮菌体于96孔板(b)中，充分混悬后，将封板膜覆盖在96孔板(b)上，置于25～37℃的环境中静置，以使溶液ⅱ中的成分充分作用于酵母细胞壁；
5、所述溶液ⅱ的组成为：50～60mmol/l naoh，30～50mmol/l tris-hcl，5～10mmol/l edta，0.5～1‰tritonx-100，溶液ⅱ的ph为9.5～10.5；
6、(3)将96孔板(b)放入微波炉中，在400～800w功率条件下加热1～2min，以加热悬浮有菌体的溶液ⅱ；
7、(4)将96孔板(b)从微波炉中取出后，剧烈震动多次，使其充分释放基因组dna，然后放入离心机中离心，沉淀杂质，所得上清液即为酵母基因组dna溶液。
8、根据本专利技术一种优选实施方式，所述溶液ⅰ为10mmol/l pbs ph7.2；所述溶液ⅱ的组成为：55mmol/l naoh，40mmol/l tris-hcl ph7.0，5mmol/l edta，0.5‰tritonx-100。
9、根据本专利技术一种优选实施方式，步骤(1)中，向96孔板(a)中分装溶液i的体积为10～15μl。步骤(2)中，向96孔板(b)中分装溶液ⅱ的体积为90～95μl，吸取的96孔板(a)中悬浮菌体的体积为5～10μl。
10、根据本专利技术一种优选实施方式，步骤(2)中，静置的时间为3～5分钟。
11、根据本专利技术一种优选实施方式，步骤(3)中，微波炉加热的功率为500～700w。具体地，可以选择市售常规微波炉的中火、中高火或高火。
12、根据本专利技术一种优选实施方式，步骤(4)中，将96孔板(b)从微波炉中取出后，弹动所述96孔板(b)使其剧烈震动5～10次。出于操作简便考虑，可直接用手指进行弹动。
13、根据本专利技术一种优选实施方式，步骤(4)中，离心的条件包括：以10000～12000rpm离心30s～60s。
14、根据本专利技术一种优选实施方式，所述96孔板为平面pcr板，本专利技术对所述96孔板的孔体积没有特别限定，优选体积为0.2ml的平面pcr板；所述封板膜为透明pcr封板膜。
15、本专利技术的方法适用于各种酵母dna的提取，包括但不限于毕赤酵母、酿酒酵母或乳酸克鲁维酵母。
16、本专利技术的上述方法可用于在酵母基因工程中，采用本专利技术方法得到的酵母基因组dna可作为pcr扩增体系的模板。
17、本专利技术的主要特征是：采用碱性缓冲液与微波处理酵母细胞相偶联的方法，其具有显著优点。首先，将菌体混悬于溶液ⅱ中，溶液ⅱ的碱性环境及其组分有助于破坏酵母细胞壁和细胞膜，同时稳定基因组dna。随后，将处理好的酵母菌液置于微波环境当中，微波以每秒2450mhz的频率穿透物料，使酵母细胞内的水、多糖、蛋白质等极性分子以相同的频率振荡，通过分子间的碰撞产生的大量摩擦热，导致胞内水分温度升高并汽化，从而实现细胞的膨胀与破裂，与煮沸法通过外部加热不同的是，微波法能使酵母细胞内外同时均匀受热，且升温速率更快。酵母裂解释放的蛋白质等杂质在碱作用下迅速变性，减少对后续基因操作的干扰。
18、相较于传统的酵母基因组dna制备方法，本专利技术提供的快速制备酵母基因组dna的方法对溶液组分和提取方法进行了改进和创新。其优点包括：
19、①溶液ⅱ中所使用的naoh和1m tris-hcl ph7.0的配比经过优化，使最终的溶液ph值维持在9.5～1本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种快速提取酵母基因组DNA的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，向96孔板(A)中分装溶液I的体积为10～15μL。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，向96孔板(B)中分装溶液Ⅱ的体积为90～95μL，吸取的96孔板(A)中悬浮菌体的体积为5～10μL；静置的时间为3～5分钟。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，微波炉加热的功率为500～700W。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，将96孔板(B)从微波炉中取出后，弹动所述96孔板(B)使其剧烈震动5～10次。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，离心的条件包括：以10000～12000rpm离心30s～60s。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述96孔板为平面PCR板；所述封板膜为透明PCR封板膜。
9.根据权利要求1所述的
10.权利要求1-9中任意一项所述的方法在酵母基因工程中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种快速提取酵母基因组dna的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，向96孔板(a)中分装溶液i的体积为10～15μl。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，向96孔板(b)中分装溶液ⅱ的体积为90～95μl，吸取的96孔板(a)中悬浮菌体的体积为5～10μl；静置的时间为3～5分钟。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，微波炉加热的功率为500～700w。
【专利技术属性】
技术研发人员：杨江科，苗润发，朱美鑫，田小笛，鲍丙杰，
申请(专利权)人：武汉轻工大学，
类型：发明
国别省市：
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