【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于spr，具体涉及一种用于细胞固定的表面等离子体基元共振芯片及其制备方法。
技术介绍
1、表面等离子体基元共振（spr）技术是检测分子间作用动力学常数和热力学常数，以及分子浓度最常用的免标记方法之一。近年来，随着biosensing等公司开发的spr显微镜技术的发展，spr技术的检测范围逐渐延伸到细胞相关领域，如细胞与分子、细胞与病毒、细胞与材料等结合的动力学常数和热力学常数的定量分析，对解决相关研究领域的力学定量技术问题有重要启发，相关定量分析的基础包括特定细胞的抓取、固定和检测等。
2、spr技术进行检测的基础是芯片，spr芯片由玻璃基底和金属薄膜构成，常见的芯片表面修饰的金属薄膜主要成分是金原子（金芯片），其他金属如银和铜等也可以用作spr芯片的金属基底层。金芯片具有良好的稳定性，因此，也是商品化spr芯片表面修饰金属薄膜的主要成分。然而，金原子易与多种生物分子结合（如蛋白质分子中的-nh2），在金芯片表面产生非特异性吸附。因此，未经修饰的金芯片（裸金芯片）通常无法直接用于相关检测研究。实用型商品化spr芯片构建的首要条件是降低芯片表面的非特异性吸附。
3、对于细胞检测而言，传统的芯片无法兼顾非特异性吸附和细胞固定的需求。通过多聚赖氨酸等方法修饰的芯片，虽然能实现细胞固定，但即使在纯蛋白和核酸检测过程中的非特异性吸附依然严重。在进行复杂生物体系检测过程中，非特异性吸附将会更加严重，这些都直接制约了spr细胞检测技术的发展。
技术实现思路
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2、本专利技术首先利用au−s键合作用实现化合物在spr芯片表面的固定，为后续的修饰提供条件；然后在芯片表面固定一层强疏水性的化合物为后续化合物修饰提供支持；最后在芯片表面修饰一层强亲水性化合物，并使之形成紧密排列的水凝胶结构。一方面，通过强亲水性化合物表面的羟基和羧基等的解离，使芯片表面带负电荷，电荷排斥作用降低了蛋白质等带负电荷生物分子在其表面的吸附；另一方面，亲水性基团还为细胞完整性的保持提供了条件。此外，羟基和羧基等活性基团还为芯片表面细胞固定位点的结合提供了条件。
3、一种用于细胞固定的表面等离子体基元共振芯片，由下至上包括依次相连的固体支撑层、支持层、稳定层和结合层；
4、所述固体支撑层为未修饰的spr金芯片；所述支持层为疏水层，所述支持层的一端通过巯基固定于固体支撑层上，另一端通过活性基团之间的反应与稳定层相连；
5、所述稳定层由多糖链段构成，所述多糖链段中与芯片表面相对的一侧，通过活性基团之间的反应与结合层相连；
6、所述结合层组分选自黏着蛋白、细胞黏附特异性位点、糖蛋白识别分子、细胞膜表面蛋白、磷脂分子抗体或多聚赖氨酸中的至少一种。
7、优选的，所述支持层由疏水性的长链烷烃固定于所述固体支撑层而得。由于金属镀层表面为富电子结构，与较多的亲水性基团有结合作用，因此，本专利技术选择疏水性且可以实现均匀排布的长链烷烃在其表面形成一层致密的结构，从而防止后续修饰中水凝胶与金属层的结合。同时，由于该结构为疏水结构，与后续修饰的水凝胶间作用力较低，也为水凝胶的均匀分布提供了条件。这些都有利于降低非特异性吸附。支持层的作用即，为后续修饰提供支持作用，防止稳定层和结合层分子与芯片表面金属原子结合而导致水凝胶坍塌，结构不稳定。本专利技术所选择的支持层的疏水性烷烃通过巯基固定于支撑层的金属表面，烷烃链的另一端为高反应活性基团。
8、优选的，所述多糖为葡聚糖或纳米纤维素。进一步优选的，所述稳定层中葡聚糖链段或纳米纤维素链段的重复单元数为10-400000。
9、所述稳定层的作用为降低芯片表面的非特异性吸附，提高芯片表面的亲水性，为细胞的稳定存在提供条件。
10、所述葡聚糖层或纳米纤维素层通过一端连有疏水性烷烃的巯基化试剂接枝于芯片表面，所述烷烃的另一端为高反应活性基团，所述高反应活性基团为羟基、羧基、生物素或醛基，高反应活性基团为葡聚糖或纳米纤维素表面羟基的接枝提供条件。
11、所述结合层用于细胞附着，为细胞的黏附、存活和增殖提供条件。所述结合层存在于稳定层的葡聚糖或纳米纤维素与芯片表面相对的另一侧表面。
12、优选的，所述黏着蛋白选自纤连蛋白、层粘蛋白、胶原、巢蛋白、生腱蛋白、血小板反应蛋白、硫酸肝素糖蛋白中的任意一种。所述黏着蛋白中包含与细胞有结合作用的特异性结合位点。所述的糖蛋白识别分子能与细胞表面糖蛋白进行特异性识别。
13、如图1中所示，所述芯片包含特异性吸附组分（结合层）和抗非特异性吸附组分（支持层和稳定层），两者分层分布于芯片表面，相互配合实现芯片表面细胞的固定和非特异性吸附的控制。考虑到细胞表面蛋白和磷脂的分布在细胞固定中的作用方式，以及细胞表面蛋白、磷脂和糖类组成结构，特异性吸附部分为裸漏在芯片表面三维水凝胶外部的部分，需要具备与蛋白、磷脂或糖类这三类物质进行结合的条件。而考虑到实际检测过程中样品的复杂性，在进行非特异性吸附控制的时候，则需要保证抗非特异性吸附组分所采用的化合物的结构不会对细胞的黏附和细胞膜的完整性产生影响，同时不能与待检测组分结合，因此，抗非特异性吸附组分结构应该是疏水性和亲水性相间，其在芯片表面分布形成的结构应当是极性分布不断变化的。同时，为了特异性吸附和抗非特异性吸附的配合使用，在进行芯片表面结构设计的时候，还需要考虑两者能相互作用在芯片表面形成一定厚度的凝胶结构排布，从而阻挡待测组分中的一种或多种化合物与金的结合产生的非特异性吸附。
14、本专利技术还提供上述用于细胞固定的表面等离子体基元共振芯片的制备方法。
15、所述稳定层由葡聚糖组成时，包括以下步骤：
16、（1）将spr金芯片浸泡于巯基试剂的乙醇溶液中，室温下浸泡时间为12 ~ 36 h，得到巯基试剂修饰的芯片；所述巯基试剂为6-巯基-1-己醇、16-巯基十六酸、11-巯基十一烷酸或6-巯基己胺；
17、（2）当巯基试剂末端为非羧基基团时，首先利用氢氧化钠和溴乙酸或氯乙酸将步骤（1）的芯片表面的巯基试剂另一端的非羧基转化为羧基，而后利用edc/dmap将葡聚糖固定到spr芯片表面；当巯基试剂末端为羧基时，直接采用edc/dmap将葡聚糖固定到芯片表面；
18、（3）将步骤（2）所述的芯片浸泡于氢氧化钠和溴乙酸或氯乙酸的混合溶液中，将葡聚糖表面的部分羟基转化为羧基，清洗干净，羟基转化比例为1-10%；
19、（4）利用edc/nhs将清洗干净的芯片表面的羧基激活，通过酰胺键将细胞结合蛋白固定到芯片表面，形成结合层，为细胞的固定提供条件。
20、优选的，步骤（1）中巯基试剂在乙醇中的浓度为0.01-50mg/ml。
21、步骤（2）中巯基试剂另一端为羧基时，通过edc/dmap催化的酯化反应将葡聚糖固定到芯片表面。
22、优本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于细胞固定的表面等离子体基元共振芯片，其特征在于，由下至上包括依次相连的固体支撑层、支持层、稳定层和结合层；
2.根据权利要求1所述的用于细胞固定的表面等离子体基元共振芯片，其特征在于，所述支持层由疏水性的长链烷烃固定于所述固体支撑层而得；优选的，所述多糖为葡聚糖或纳米纤维素。
3.根据权利要求1所述的用于细胞固定的表面等离子体基元共振芯片，其特征在于，所述稳定层中多糖链段的重复单元数为10-400000；优选的，结合层蛋白选自纤连蛋白、层粘蛋白、胶原、巢蛋白抗体、生腱蛋白、血小板反应蛋白抗体、硫酸肝素糖蛋白抗体中的任意一种。
4.根据权利要求2或3所述的用于细胞固定的表面等离子体基元共振芯片的制备方法，其特征在于，所述稳定层由葡聚糖组成时，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的用于细胞固定的表面等离子体基元共振芯片的制备方法，其特征在于，步骤（1）中巯基试剂在乙醇中的浓度为0.01-50mg/mL；
6.根据权利要求4所述的用于细胞固定的表面等离子体基元共振芯片的制备方法，其特征在于，所述稳定层由纳米纤维素
7.根据权利要求6所述的用于细胞固定的表面等离子体基元共振芯片的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述巯基化试剂的乙醇溶液中巯基化试剂的浓度为0.1-50mM；
8.根据权利要求7所述的用于细胞固定的表面等离子体基元共振芯片的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述环氧氯丙烷和氢氧化钠的混合水溶液中，环氧氯丙烷的浓度为0.1M，氢氧化钠的浓度为0.1M；
9.根据权利要求6所述的用于细胞固定的表面等离子体基元共振芯片的制备方法，其特征在于，步骤（3）的操作方法：用水将芯片清洗干净，然后将芯片浸入EDC和NHS的混合水溶液中反应1小时，所述EDC浓度为0.5M，所述NHS浓度为0.2M。
10.根据权利要求2或3所述的用于细胞固定的表面等离子体基元共振芯片的应用，其特征在于，用于SH-SY5Y细胞固定。
...【技术特征摘要】
1.一种用于细胞固定的表面等离子体基元共振芯片，其特征在于，由下至上包括依次相连的固体支撑层、支持层、稳定层和结合层；
2.根据权利要求1所述的用于细胞固定的表面等离子体基元共振芯片，其特征在于，所述支持层由疏水性的长链烷烃固定于所述固体支撑层而得；优选的，所述多糖为葡聚糖或纳米纤维素。
3.根据权利要求1所述的用于细胞固定的表面等离子体基元共振芯片，其特征在于，所述稳定层中多糖链段的重复单元数为10-400000；优选的，结合层蛋白选自纤连蛋白、层粘蛋白、胶原、巢蛋白抗体、生腱蛋白、血小板反应蛋白抗体、硫酸肝素糖蛋白抗体中的任意一种。
4.根据权利要求2或3所述的用于细胞固定的表面等离子体基元共振芯片的制备方法，其特征在于，所述稳定层由葡聚糖组成时，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的用于细胞固定的表面等离子体基元共振芯片的制备方法，其特征在于，步骤（1）中巯基试剂在乙醇中的浓度为0.01-50mg/ml；
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【专利技术属性】
技术研发人员：王晓映，马明强，许子强，孔凡功，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学山东省科学院，
类型：发明
国别省市：
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