【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本披露总体上涉及蛋白质收获/纯化领域，并且更特别地涉及具有治疗价值的生物制剂和生物仿制药蛋白产物的收获/纯化领域。
技术介绍
1、生物制剂和生物仿制药的持续开发已经揭示了这些分子为人类提供治疗益处的巨大前景。这些分子是典型地使用培养物中基于细胞的分子表达而产生的大蛋白。作为蛋白质，这些分子还经常需要翻译后修饰和适当折叠以使功能性最大化。尽管原核生物表达系统的最近进展预示了这种蛋白质表达途径的持续活力，但是这样的考虑经常导致使用真核宿主细胞来表达所希望的产物。此外，细胞培养技术的发展已经导致产生蛋白质(如生物制剂和生物仿制药)的培养物的细胞密度显著增加，这显示了增加这样的产物的产率的前景，但是这是以增加来自细胞培养操作的污染物水平为代价的。特别地，易变的真核细胞的使用与一定水平的细胞裂解相关，这产生了不想要的生物分子(如核酸、蛋白质、脂质等)连同细胞膜片段的污染存在。鉴于来自使用高密度细胞培养物的产率的潜在增加，需要解决存在增加的污染物的收获或纯化方法。
2、用于在细胞培养物中表达的蛋白质的传统纯化方案涉及上游细胞培养流出物处理，其集中于各种形式的离心和/或各种形式的深度过滤，其中具有任选的絮凝或沉淀的初始步骤以去除流出物中的一些污染物。下游精制步骤已经涉及一种或多种色谱分级，该一种或多种色谱分级涉及例如亲和色谱、离子交换色谱、疏水相互作用色谱和其他形式的色谱。涉及精制靶蛋白(如生物制剂和生物仿制药)的纯化的典型亲和色谱步骤是蛋白a色谱，众所周知该蛋白a色谱用于纯化免疫球蛋白样蛋白(如抗体)。离子交换色谱通常涉及阴离子
3、使用基于细胞培养物的表达系统来产生治疗性生物制剂和生物仿制药需要这些多步骤纯化方案以确保指定用于向人类施用的产物的足够纯度。为了确保足够的纯度，全世界的政府监管机构已经形成了必须满足的严格标准，包括在美国要求满足质量靶蛋白特征(quality target protein profiles)，这是用于纯化待向人类施用的产品的严格标准。需要获得政府批准以施用生物制剂和生物仿制药的要求已经产生了对在培养物中表达的更高纯度的产品的持续需求。因此，本领域仍然需要改进蛋白质收获/纯化方法，以产生具有降低的水平和种类数量的基于培养物的污染物的蛋白质靶产物。
技术实现思路
1、本披露提供了提高在细胞培养物中产生的靶蛋白(例如生物制剂和生物仿制药)的纯度的方法。本披露在纯化来自细胞培养物的蛋白质的下游方面采用与常规技术相悖的方法。更特别地，在纯化来自细胞培养物的蛋白质的下游精制阶段中，本披露依赖于在超滤/渗滤(uf/df)步骤之前的一种或多种色谱步骤，这与常规纯化方案一致，但接着采用返回到涉及至少混合模式色谱或离子交换色谱(例如，阳离子交换色谱)步骤的色谱分级的不寻常步骤。本披露的纯化方法导致显著减少污染纯化的靶蛋白材料的不希望的高分子量(hmw)材料，同时使该靶蛋白的产率的降低最小化。在靶收获/纯化的精制阶段后期添加这一不寻常步骤时，该方法改进了对所有形式的高分子量化合物(包括核酸、蛋白质、脂质和在基于细胞的靶蛋白产生方法中发现的其他形式的高分子量化合物)的去除。结果是具有更高纯度的靶蛋白，该靶蛋白展现出符合质量靶蛋白特征的改进特征。
2、在一个方面，本披露提供了一种从宿主细胞培养液中收获靶蛋白的方法，该方法包括超滤/渗滤(uf/df)步骤后的色谱步骤，其中与该uf/df滤液中的高分子量物质的水平相比，来自该色谱步骤的洗脱液中的高分子量物质减少了至少10％。在一些实施例中，该方法进一步包括在超滤/渗滤步骤前的至少一个色谱步骤。在一些实施例中，至少一个色谱步骤包括蛋白a色谱。在一些实施例中，至少一个色谱步骤进一步包括离子交换色谱、混合模式色谱、或离子交换色谱和混合模式色谱两者。在一些实施例中，该方法进一步包括将该宿主细胞培养液离心、深度过滤、或离心和深度过滤两者的上游批量收获步骤，以及随后将该靶蛋白纯化的下游精制步骤，其中该精制步骤包括蛋白a色谱步骤、低ph病毒失活步骤、阳离子交换步骤、混合模式阴离子交换色谱步骤、病毒过滤步骤、超滤/渗滤步骤、在该超滤/渗滤步骤后的色谱步骤、聚山梨醇酯80添加步骤和最终过滤步骤。
3、提供了该方法的仍其他实施例，其中经受色谱步骤的靶蛋白存在于包含10mm谷氨酸、250mm苏氨酸的配制品缓冲液(ph 5.5)中。在一些实施例中，色谱步骤的排出物是洗脱液，其中与uf/df滤液中的水平相比，高分子量化合物减少了至少9％。在一些实施例中，与uf/df滤液中的水平相比，洗脱液中的高分子量化合物减少了至少20％、至少25％、至少30％或至少75％。在一些实施例中，色谱步骤的排出物是包含0.3％-1.9％高分子量化合物的洗脱液。在一些实施例中，来自色谱步骤的靶蛋白的产率为至少58％、60％、65％、70％、75％、80％、86％、至少90％、至少95％或至少98％。
4、披露了该方法的一些实施例，其中该色谱介质是混合模式树脂、混合模式膜、离子交换树脂或离子交换膜。在一些实施例中，色谱介质是ca++pure-ha、capt0 mmc、capto mmcimpres、capto spimpres、capto adhere、cimultus primas、cimultus hbond、cmmhypercel、eshmuno cp-ft、eshmuno hcx、fibro mmc、fibro adhere、fractogel coo-(m)、fractogel so3-(m)、mustang xt s、nuvia s、nuvia hr-s、nuvia cprime、sartobindphenyl、toyopearl mx-trp、toyopearl sulfate650m或unosphere s。在一些实施例中，色谱介质是ca++pureha、capto mmc、capto mmc impres、capto adhere、cmm hypercel、eshmuno hcx、fibro mmc、fibro adhere、nuvia cprime、toyopearl mx-trp或toyopearlsulfate。在一些实施例中，色谱介质是capto mmc impres、eshmuno hcx、eshmuno cp-ft、fibro mmc或nuvia cprime。在一些实施例中，色谱介质是fibro mmc或nuvia cprime。在一些实施例中，色谱介质是膜。在一些实施例中，将包含靶蛋白的流体以至少400克/升树脂的加载因子应用到色谱介质中，包括其中加载因子在400-800克/升树脂之间的实施例和其中加载因子为至少800克/升树脂的实施例。
5、该方法还提供了其中加载hmw％是至少0.5本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种从宿主细胞培养液中收获靶蛋白的方法，该方法包括超滤/渗滤(UF/DF)步骤后的色谱步骤，其中与该UF/DF滤液中的高分子量物质的水平相比，来自该色谱步骤的洗脱液中的高分子量物质减少了至少10％。
2.如权利要求1所述的方法，该方法进一步包括该超滤/渗滤步骤前的至少一种色谱步骤。
3.如权利要求2所述的方法，其中该至少一种色谱步骤包括蛋白A色谱。
4.如权利要求3所述的方法，其中该至少一种色谱步骤进一步包括离子交换色谱、混合模式色谱、或离子交换色谱和混合模式色谱两者。
5.如权利要求1所述的方法，该方法进一步包括将该宿主细胞培养液离心、深度过滤、或离心和深度过滤两者的上游批量收获步骤，以及随后将该靶蛋白纯化的下游精制步骤，其中该精制步骤包括蛋白A色谱步骤、低pH病毒失活步骤、阳离子交换步骤、混合模式阴离子交换色谱步骤、病毒过滤步骤、超滤/渗滤步骤、在该超滤/渗滤步骤后的色谱步骤、添加聚山梨醇酯80步骤和最终过滤步骤。
6.如权利要求1所述的方法，其中经受该色谱步骤的该靶蛋白存在于包含10mM谷氨酸、250mM苏氨酸
7.如权利要求1所述的方法，其中该色谱步骤的排出物是洗脱液，其中与该UF/DF滤液中的水平相比，该高分子量化合物减少了至少9％。
8.如权利要求7所述的方法，其中与该UF/DF滤液中的水平相比，该洗脱液中的高分子量化合物减少了至少20％。
9.如权利要求7所述的方法，其中与该UF/DF滤液中的水平相比，该洗脱液中的高分子量化合物减少了至少25％。
10.如权利要求7所述的方法，其中与该UF/DF滤液中的水平相比，该洗脱液中的高分子量化合物减少了至少30％。
11.如权利要求7所述的方法，其中与该UF/DF滤液中的水平相比，该洗脱液中的高分子量化合物减少了75％。
12.如权利要求1所述的方法，其中该色谱步骤的排出物是包含0.3％-1.9％高分子量化合物的洗脱液。
13.如权利要求1所述的方法，其中来自该色谱步骤的该靶蛋白的产率为至少58％。
14.如权利要求13所述的方法，其中来自该色谱步骤的该靶蛋白的产率为至少86％。
15.如权利要求1所述的方法，其中来自该色谱步骤的该靶蛋白的产率为至少90％。
16.如权利要求1所述的方法，其中来自该色谱步骤的该靶蛋白的产率为至少95％。
17.如权利要求1所述的方法，其中来自该色谱步骤的该靶蛋白的产率为至少98％。
18.如权利要求1所述的方法，其中该色谱介质是混合模式树脂、混合模式膜、离子交换树脂或离子交换膜。
19.如权利要求18所述的方法，其中该色谱介质是Ca++Pure-HA、Capto MMC、Capto MMCImpRes、Capto SPImpRes、Capto Adhere、CIMultus PrimaS、CIMultus Hbond、CMMHypercel、Eshmuno CP-FT、Eshmuno HCX、Fibro MMC、Fibro Adhere、Fractogel COO-(M)、Fractogel SO3-(M)、Mustang XT S、Nuvia S、Nuvia HR-S、Nuvia cPrime、SartobindPhenyl、ToyoPearl MX-Trp、ToyoPearl Sulfate 650M或UNOsphere S。
20.如权利要求18所述的方法，其中该色谱介质是Ca++PureHA、Capto MMC、Capto MMCImpRes、Capto Adhere、CMM Hypercel、Eshmuno HCX、Fibro MMC、Fibro Adhere、NuviacPrime、ToyoPearl mX-Trp或ToyoPearl Sulfate。
21.如权利要求20所述的方法，其中该色谱介质是Capto MMC ImpRes、Eshmuno HCX、Eshmuno CP-FT、Fibro MMC或Nuvia cPrime。
22.如权利要求21所述的方法，其中该色谱介质是Fibro MMC或Nuvia cPrime。
23.如权利要求19所述的方法，其中该色谱介质是膜。
24.如权利要求1所述的方法，其中将包含该靶蛋白的该流体以至少400克/升树脂的加载因子应用到该色谱介质中。
25.如权利要求24所述的方法，其中该加载因子在400-800克/升树脂之间。
26.如权利要求24所述的...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种从宿主细胞培养液中收获靶蛋白的方法，该方法包括超滤/渗滤(uf/df)步骤后的色谱步骤，其中与该uf/df滤液中的高分子量物质的水平相比，来自该色谱步骤的洗脱液中的高分子量物质减少了至少10％。
2.如权利要求1所述的方法，该方法进一步包括该超滤/渗滤步骤前的至少一种色谱步骤。
3.如权利要求2所述的方法，其中该至少一种色谱步骤包括蛋白a色谱。
4.如权利要求3所述的方法，其中该至少一种色谱步骤进一步包括离子交换色谱、混合模式色谱、或离子交换色谱和混合模式色谱两者。
5.如权利要求1所述的方法，该方法进一步包括将该宿主细胞培养液离心、深度过滤、或离心和深度过滤两者的上游批量收获步骤，以及随后将该靶蛋白纯化的下游精制步骤，其中该精制步骤包括蛋白a色谱步骤、低ph病毒失活步骤、阳离子交换步骤、混合模式阴离子交换色谱步骤、病毒过滤步骤、超滤/渗滤步骤、在该超滤/渗滤步骤后的色谱步骤、添加聚山梨醇酯80步骤和最终过滤步骤。
6.如权利要求1所述的方法，其中经受该色谱步骤的该靶蛋白存在于包含10mm谷氨酸、250mm苏氨酸的ph为5.5的配制品缓冲液中。
7.如权利要求1所述的方法，其中该色谱步骤的排出物是洗脱液，其中与该uf/df滤液中的水平相比，该高分子量化合物减少了至少9％。
8.如权利要求7所述的方法，其中与该uf/df滤液中的水平相比，该洗脱液中的高分子量化合物减少了至少20％。
9.如权利要求7所述的方法，其中与该uf/df滤液中的水平相比，该洗脱液中的高分子量化合物减少了至少25％。
10.如权利要求7所述的方法，其中与该uf/df滤液中的水平相比，该洗脱液中的高分子量化合物减少了至少30％。
11.如权利要求7所述的方法，其中与该uf/df滤液中的水平相比，该洗脱液中的高分子量化合物减少了75％。
12.如权利要求1所述的方法，其中该色谱步骤的排出物是包含0.3％-1.9％高分子量化合物的洗脱液。
13.如权利要求1所述的方法，其中来自该色谱步骤的该靶蛋白的产率为至少58％。
14.如权利要求13所述的方法，其中来自该色谱步骤的该靶蛋白的产率为至少86％。
15.如权利要求1所述的方法，其中来自该色谱步骤的该靶蛋白的产率为至少90％。
16.如权利要求1所述的方法，其中来自该色谱步骤的该靶蛋白的产率为至少95％。
17.如权利要求1所述的方法，其中来自该色谱步骤的该靶蛋白的产率为至少98％。
18.如权利要求1所述的方法，其中该色谱介质是混合模式树脂、混合模式膜、离子交换树脂或离子交换膜。
19.如权利要求18所述的方法，其中该色谱介质是ca++pure-ha、capto mmc、capto mmcimpres、capto spimpres、capto adhere、cimultus primas、cimultus hbond、cmmhypercel、eshmuno cp-ft、eshmuno hcx、fibro mmc、fibro adhere、fractogel coo-(m)、fractogel so3-(m)、mustang xt s、nuvia s、nuvia hr-s、nuvia cprime、sartobindphenyl、toyopearl mx-trp、toyopearl sulfate 650m或unosphere s。
...【专利技术属性】
技术研发人员：A·阿西瓦拉，H·比默，D·乌帕迪亚伊，
申请(专利权)人：美国安进公司，
类型：发明
国别省市：
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