【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于，具体涉及一种高效高通量植物组织mrna-seq测序文库制备方法。
技术介绍
1、转录组指细胞在特定生长时期或特定生理条件下的全套转录本的特征和数量。转录组学研究内容主要包括转录本的丰度、分类、基因转录结构和转录后修饰等，旨在揭示转录本参与调控基因组结构和复杂生物学过程的机制。
2、rna-seq作为目前转录组学研究的有力工具，可以通过深度测序快速获得细胞或组织特异性的转录本核酸序列，基因表达丰度，转录本结构以及可变剪接类型等信息，传统rna-seq主要的实验步骤主要包括细胞或组织total rna的抽提、mrna捕获或rrna去除、rna片段化、cdna一链合成、二链合成、末端修复加a、测序接头连接和文库扩增等，过程较为繁琐，成本较高；tn5转座酶被广泛应用于二代测序dna文库的构建，其可以随机标记并切割双链dna以及双链rna：dna，被证实可以用于rna-seq文库的构建，代表技术主要有sherry(sequencing hetero rna-dna-hybrid)和smart-seq2，测试对象主要是动物细胞。以上方法通常只能应用到样品数量少的动物实验中，无法在短期内实现大批量rna-seq文库的制备，尤其是在植物转录组研究中。所以，植物高通量转录组文库的制备方法的开发是很有必要的，本技术在以上技术(sherry)的基础，简化了操作步骤，降低了实验成本，实现了在一天之内完成至少96个不同植物组织样品的mrna-seq文库制备。
技术实现思路
1、为
2、为了解决上述技术问题，本专利技术提供了如下的技术方案：
3、本专利技术提供一种高效高通量植物组织mrna-seq测序文库制备方法，包括以下步骤：
4、(1)将植物样品、trizol一起研磨，室温静置，随后在室温下离心；
5、(2)向步骤(1)研磨后的样品中加入1-溴-3-氯丙烷，涡旋震荡，室温静置，随后在4℃离心；
6、(3)取步骤(2)离心之后的上清，加入异丙醇，颠倒混匀，置于-20℃醇沉，随后在4℃离心；
7、(4)弃掉步骤(3)离心后的上清，可见白色沉淀；用75％乙醇漂洗沉淀，随后在4℃下离心；
8、(5)弃掉步骤(4)离心后的上清，随后在4℃下离心；
9、(6)弃掉步骤(5)离心后的多余液体，晾干沉淀至半透明状，随后用rnase-freewater溶解沉淀；
10、(7)nanodrop2000测total rna浓度；取total rna至pcr板中，使用vazyme mrnacapture beads从total rna中富集mrna；
11、(8)cdna一链合成；
12、(9)进行tn5酶切；
13、(10)加入dna clean beads，吸打混匀，室温静置；
14、(11)磁力架上弃上清，加入80％乙醇漂洗beads，重复2次；
15、(12)弃掉多余乙醇，晾干beads；用rnase-free water洗脱；收集上清至新的pcr板中；
16、(13)pcr文库扩增；
17、(14)向步骤(13)获得的pcr产物中加入0.55×dna clean beads，吸打混匀，室温静置；随后磁力架上收集上清置于新的pcr板中；
18、(15)在步骤(14)中收集的上清中加入0.25×dna clean beads，吸打混匀，室温静置；随后磁力架上弃上清，加入80％乙醇漂洗beads，重复2次；
19、(16)弃掉多余乙醇，晾干beads；用rnase-free water洗脱；收集文库上清至新的pcr板中；
20、(17)检测mrna-seq文库浓度。
21、优选的，所述步骤(1)中使用球型研磨仪研磨，球型研磨仪用液氮速冻，研磨使用96孔深孔板放入待研磨材料，室温静置5～10min；离心转速4000～5000rpm，离心时间3～6min。
22、优选的，所述步骤(2)中涡旋震荡30～45s，室温静置10～18min；离心转速4000～5000rpm，离心时间15～20min。
23、优选的，所述步骤(3)中取的离心之后的上清和异丙醇的体积比为1：1，醇沉时间不少于30min；离心转速4000～5000rpm，离心时间20～25min；所述步骤(4)中离心转速4000～5000rpm，离心时间5～10min；所述步骤(5)中离心转速4000～5000rpm，离心时间5～10min。
24、优选的，所述步骤(6)溶解10～20min，96孔深孔板置于60～70℃金属浴溶解。
25、优选的，所述步骤(8)中每孔反应体系如下：10μl mrna(10ng-100ng)、2μl oligod(t)23vn primer(50μm)、2μl10×m-mulv buffer、1μl m-mulv rt(200u/μl)、1μl 10mmdntps mix、0.5μlrnase inhibitor(40u/μl)、3.5μlrnase-free water；将反应体系置于pcr仪上按以下程序进行反应：lid，105℃；42℃、1h；65℃、20min。
26、优选的，所述步骤(9)中使用以下反应体系进行tn5酶切：4μl ttemixv50、8μl 5×ttbl、20μl步骤(9)中反应产物、8μl rnase-free water；将以上体系置于pcr仪上按以下程序进行反应：105℃，lid；55℃，10min；4℃，hold。
27、优选的，所述步骤(13)使用以下反应体系进行pcr文库扩增：10μl 5×tab、5μlppm、1μltae、5μl n6xx、5μl n8xx、24μl步骤21中上清；将以上体系置于pcr仪上按以下程序进行反应：105℃，lid；72℃，3min；98℃，3min；98℃、15s，60℃、30s，72℃、1min，以上温度进行8-11cys；72℃，5min；4℃，hold。
28、优选的，所述步骤(10)室温静置5～10min；所述步骤(14)室温静置5～10min。
29、本专利技术相较于现有技术，具有以下有益效果：
30、本专利技术操作全程在96深孔板以及96孔pcr板中进行，可同时实现不少于96种不同组织样品的mrna-seq文库构建。
31、本专利技术包括total rna抽提、mrna富集、cdna一链合成、tn5转座、pcr扩增、文库片段筛选，相较于传统的mrna-seq少了cdna第二链的合成、末端修复加a以及测序接头的额外连接，极大地简化了操作流程，可在一天之内构建完成96种不同组织样品的mrna-seq文库。
32、本专利技术使用球型研磨仪湿磨裂本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高效高通量植物组织mRNA-seq测序文库制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种高效高通量植物组织mRNA-seq测序文库制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中使用球型研磨仪研磨，球型研磨仪用液氮速冻，研磨使用96孔深孔板放入待研磨材料，室温静置5～10min；离心转速4000～5000rpm，离心时间3～6min。
3.根据权利要求2所述的一种高效高通量植物组织mRNA-seq测序文库制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中涡旋震荡30～45s，室温静置10～18min；离心转速4000～5000rpm，离心时间15～20min。
4.根据权利要求3所述的一种高效高通量植物组织mRNA-seq测序文库制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中取的离心之后的上清和异丙醇的体积比为1：1，醇沉时间不少于30min；离心转速4000～5000rpm，离心时间20～25min；所述步骤(4)中离心转速4000～5000rpm，离心时间5～10min；所述步骤(5)中离心转速4000～5000rpm，离心时间5～10min
5.根据权利要求4所述的一种高效高通量植物组织mRNA-seq测序文库制备方法，其特征在于，所述步骤(6)溶解10～20min，96孔深孔板置于60～70℃金属浴溶解。
6.根据权利要求5所述的一种高效高通量植物组织mRNA-seq测序文库制备方法，其特征在于，所述步骤(8)中每孔反应体系如下：10μLmRNA(10ng-100ng)、2μL oligo d(T)23VNPrimer(50μM)、2μL10×M-MuLV buffer、1μL M-MuLV RT(200U/μL)、1μL 10mM dNTPs mix、0.5μLRNase Inhibitor(40U/μL)、3.5μL RNase-free Water；将反应体系置于PCR仪上按以下程序进行反应：Lid，105℃；42℃、1h；65℃、20min。
7.根据权利要求6所述的一种高效高通量植物组织mRNA-seq测序文库制备方法，其特征在于，所述步骤(9)中使用以下反应体系进行Tn5酶切：4μLTTEmixV50、8μL 5×TTBL、20μL步骤(9)中反应产物、8μL RNase-free Water；将以上体系置于PCR仪上按以下程序进行反应：105℃，Lid；55℃，10min；4℃，Hold。
8.根据权利要求7所述的一种高效高通量植物组织mRNA-seq测序文库制备方法，其特征在于，所述步骤(13)使用以下反应体系进行PCR文库扩增：10μL 5×TAB、5μL PPM、1μLTAE、5μL N6XX、5μL N8XX、24μL步骤21中上清；将以上体系置于PCR仪上按以下程序进行反应：105℃，Lid；72℃，3min；98℃，3min；98℃、15s，60℃、30s，72℃、1min，以上温度进行8-11cycles；72℃，5min；4℃，Hold。
9.根据权利要求7所述的一种高效高通量植物组织mRNA-seq测序文库制备方法，其特征在于，所述步骤(10)室温静置5～10min；所述步骤(14)室温静置5～10min。
...【技术特征摘要】
1.一种高效高通量植物组织mrna-seq测序文库制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种高效高通量植物组织mrna-seq测序文库制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中使用球型研磨仪研磨，球型研磨仪用液氮速冻，研磨使用96孔深孔板放入待研磨材料，室温静置5～10min；离心转速4000～5000rpm，离心时间3～6min。
3.根据权利要求2所述的一种高效高通量植物组织mrna-seq测序文库制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中涡旋震荡30～45s，室温静置10～18min；离心转速4000～5000rpm，离心时间15～20min。
4.根据权利要求3所述的一种高效高通量植物组织mrna-seq测序文库制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中取的离心之后的上清和异丙醇的体积比为1：1，醇沉时间不少于30min；离心转速4000～5000rpm，离心时间20～25min；所述步骤(4)中离心转速4000～5000rpm，离心时间5～10min；所述步骤(5)中离心转速4000～5000rpm，离心时间5～10min。
5.根据权利要求4所述的一种高效高通量植物组织mrna-seq测序文库制备方法，其特征在于，所述步骤(6)溶解10～20min，96孔深孔板置于60～70℃金属浴溶解。
6.根据权利要求5所述的一种高效高通量植物组织mrna-seq测序文库制备方法，其特征在于，所述步骤(8)中每孔反应体系如下：10μlmrna(10ng-100ng)、2μl oligo d(t)23vn...
【专利技术属性】
技术研发人员：李兴旺，郭亮亮，阎加培，薛志飞，曹东临，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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