【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利申请基于日本专利申请2022-117422号(2022年7月22日提出申请)主张巴黎公约规定的优先权及利益，上述申请中记载的整体内容通过引用并入本说明书中。本专利技术涉及使用了亚磷酰胺法的寡核苷酸的制造方法。
技术介绍
1、作为核酸寡聚物的寡核苷酸是以基因检测为目的的核酸探针、pcr中使用的dna探针、作为药品的反义核酸、sirna、适配体等各种领域中利用的有用的原材料。
2、寡核苷酸可通过使用了亚磷酰胺法的固相合成法来制造。在亚磷酰胺法中，在玻璃、树脂载体上依次连接作为单体的核苷的亚磷酰胺(以下，称为“酰胺”)，制造具有任意序列的寡核苷酸。具体的制造步骤包括：使用酸性溶液对核苷酸的5’末端的羟基的保护基进行去保护的去保护步骤；使经去保护的核苷酸的5’末端的羟基与酰胺的酰胺基在激活剂存在下反应的缩合步骤；将新产生的核苷间的键从3价的磷氧化为5价的磷的氧化步骤；和将未反应的5’末端的羟基酰化的加帽步骤。通过依次重复这些步骤，从而将酰胺以任意的顺序连接，制造具有所期望的序列的寡核苷酸。
3、如专利文献1等中公开的那样，缩合步骤中使用的酰胺溶解于乙腈中，以酰胺溶液的形态使用。另一方面，在乙腈中的溶解度低的酰胺的情况下，难以使用该方法。
4、作为在乙腈中的溶解度低的酰胺之一，可举出2’-ome-u酰胺。报道了为了提高2’-ome-u酰胺的溶解度，向乙腈中追加地添加二氯甲烷(专利文献2、非专利文献1)来制备酰胺溶液。通过添加这些溶剂，2’-ome-u酰胺的溶解度提高。
5、开发了这样的
6、现有技术文献
7、专利文献
8、专利文献1：国际公开第2019/170731号
9、专利文献2：中国专利申请公开第112007040号说明书
10、非专利文献
11、非专利文献1：bioorganic&medicinal chemistry letters 28(2018)3774-3779
12、非专利文献2：mass spectrometry reviews 40(2021)75-109
技术实现思路
1、专利技术所要解决的课题
2、本专利技术的目的在于提供具有1个以上的2’-ome-u的寡核苷酸的高纯度的制造方法。
3、用于解决课题的手段
4、本申请的专利技术人为了实现上述目的而反复深入研究，结果提供一种核酸制造方法，其特征在于，使用乙腈和芳香族系烃作为2’-ome-u酰胺溶液的溶剂。
5、本专利技术包括以下的方式，但不限于这些。
6、1.寡核苷酸的制造方法，其包括使式(2)所示的化合物与式(4)所示的2’-ome-u酰胺在激活剂的存在下缩合的步骤，
7、[化学式1]
8、
9、〔式中，
10、g2表示羟基的保护基，
11、ba表示可被保护基保护的核酸碱基，
12、r表示经保护的羟基、氢原子、氟原子、甲氧基、2-甲氧基乙基、或oq’基，
13、q’表示与核糖的4’位的碳原子键合的亚烷基，
14、x表示氧原子或硫原子，并且，
15、带有＊的键表示朝向核酸的3’端侧的键。〕
16、[化学式2]
17、
18、〔式中，
19、g1表示羟基的保护基。〕
20、前述2’-ome-u酰胺溶解于包含乙腈及式(3)所示的芳香族系烃的混合液中，
21、[化学式3]
22、
23、〔式中，y1～y6相同或彼此不同，各自独立地表示氢原子、甲基、乙基或卤素原子。〕。
24、2.如[1]所述的寡核苷酸的制造方法，其中，式(3)所示的芳香族系烃为具有选自由甲基、乙基及卤素原子组成的组中的1个或2个取代基的苯，苯具有2个取代基的情况下，取代基可以相同也可以不同。
25、3.如[1]所述的寡核苷酸的制造方法，其中，式(3)所示的芳香族系烃选自由甲苯、邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯、氯苯、邻二氯苯、间二氯苯、对二氯苯、及它们中的2种以上的混合物组成的组。
26、4.如[1]～[3]中任一项所述的寡核苷酸的制造方法，其中，溶解有式(4)所示的2’-ome-u酰胺的混合液中包含的乙腈与式(3)所示的芳香族系烃的体积比率以乙腈：式(3)所示的芳香族系烃计为99：1～1：99。
27、5.如[1]～[3]中任一项所述的寡核苷酸的制造方法，其中，溶解有式(4)所示的2’-ome-u酰胺的混合液中包含的乙腈与式(3)所示的芳香族系烃的体积比率以乙腈：式(3)所示的芳香族系烃计为90：10～10：90。
28、6.如[1]～[3]中任一项所述的寡核苷酸的制造方法，其中，溶解有式(4)所示的2’-ome-u酰胺的混合液中包含的乙腈与式(3)所示的芳香族系烃的体积比率以乙腈：式(3)所示的芳香族系烃计为90：10～40：60。
29、7.如[1]～[6]中任一项所述的寡核苷酸的制造方法，其中，式(4)所示的2’-ome-u酰胺溶液中的2’-ome-u酰胺浓度为0.01～0.4m。
30、8.如[1]～[6]中任一项所述的寡核苷酸的制造方法，其中，式(4)所示的2’-ome-u酰胺溶液中的2’-ome-u酰胺浓度为0.05～0.2m。
31、9.如[1]～[8]中任一项所述的寡核苷酸的制造方法，其中，激活剂为5-苄硫基-1h-四氮唑。
32、10.如[1]～[9]中任一项所述的寡核苷酸的制造方法，其中，式(2)所示的化合物中的r为经保护的羟基的情况下，该羟基的保护基为式(10)所示的保护基：
33、[化学式4]
34、
35、〔式中，
36、q表示0～5的整数，
37、ra及rb相同或彼此不同，各自表示甲基、乙基或氢原子，
38、带有＊标记的键与2’羟基的氧键合，
39、ew表示吸电子基团。〕。
40、11.如[1]～[10]中任一项所述的寡核苷酸的制造方法，其中，在式(4)所示的2’-ome-u酰胺中，g1为4,4’-二甲氧基三苯甲基。
41、12.如[1]～[11]中任一项所述的寡核苷酸的制造方法，其利用固相合成法进行。
42、13.包含式(4)所示的2’-ome-u酰胺、乙腈及式(3)所示的芳香族系烃的溶液，
43、[化学式5]
44、...
【技术保护点】
1.寡核苷酸的制造方法，其包括使式(2)所示的化合物与式(4)所示的2’-OMe-U酰胺在激活剂的存在下缩合的步骤，
2.如权利要求1所述的寡核苷酸的制造方法，其中，式(3)所示的芳香族系烃为具有选自由甲基、乙基及卤素原子组成的组中的1个或2个取代基的苯，苯具有2个取代基的情况下，取代基可以相同也可以不同。
3.如权利要求1所述的寡核苷酸的制造方法，其中，式(3)所示的芳香族系烃选自由甲苯、邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯、氯苯、邻二氯苯、间二氯苯、对二氯苯、及它们中的2种以上的混合物组成的组。
4.如权利要求1～3中任一项所述的寡核苷酸的制造方法，其中，溶解有式(4)所示的2’-OMe-U酰胺的混合液中包含的乙腈与式(3)所示的芳香族系烃的体积比率以乙腈：式(3)所示的芳香族系烃计为99：1～1：99。
5.如权利要求1～3中任一项所述的寡核苷酸的制造方法，其中，溶解有式(4)所示的2’-OMe-U酰胺的混合液中包含的乙腈与式(3)所示的芳香族系烃的体积比率以乙腈：式(3)所示的芳香族系烃计为90：10～10：90。
6.
7.如权利要求1～6中任一项所述的寡核苷酸的制造方法，其中，式(4)所示的2’-OMe-U酰胺溶液中的2’-OMe-U酰胺浓度为0.01～0.4M。
8.如权利要求1～6中任一项所述的寡核苷酸的制造方法，其中，式(4)所示的2’-OMe-U酰胺溶液中的2’-OMe-U酰胺浓度为0.05～0.2M。
9.如权利要求1～8中任一项所述的寡核苷酸的制造方法，其中，激活剂为5-苄硫基-1H-四氮唑。
10.如权利要求1～9中任一项所述的寡核苷酸的制造方法，其中，式(2)所示的化合物中的R为经保护的羟基的情况下，该羟基的保护基为式(10)所示的保护基，
11.如权利要求1～10中任一项所述的寡核苷酸的制造方法，其中，在式(4)所示的2’-OMe-U酰胺中，G1为4,4’-二甲氧基三苯甲基。
12.如权利要求1～11中任一项所述的寡核苷酸的制造方法，其利用固相合成法进行。
13.包含式(4)所示的2’-OMe-U酰胺、乙腈及式(3)所示的芳香族系烃的溶液，
14.将权利要求13所述的包含式(4)所示的2’-OMe-U酰胺、乙腈及式(3)所示的芳香族系烃的溶液用于制造寡核苷酸的方法。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.寡核苷酸的制造方法，其包括使式(2)所示的化合物与式(4)所示的2’-ome-u酰胺在激活剂的存在下缩合的步骤，
2.如权利要求1所述的寡核苷酸的制造方法，其中，式(3)所示的芳香族系烃为具有选自由甲基、乙基及卤素原子组成的组中的1个或2个取代基的苯，苯具有2个取代基的情况下，取代基可以相同也可以不同。
3.如权利要求1所述的寡核苷酸的制造方法，其中，式(3)所示的芳香族系烃选自由甲苯、邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯、氯苯、邻二氯苯、间二氯苯、对二氯苯、及它们中的2种以上的混合物组成的组。
4.如权利要求1～3中任一项所述的寡核苷酸的制造方法，其中，溶解有式(4)所示的2’-ome-u酰胺的混合液中包含的乙腈与式(3)所示的芳香族系烃的体积比率以乙腈：式(3)所示的芳香族系烃计为99：1～1：99。
5.如权利要求1～3中任一项所述的寡核苷酸的制造方法，其中，溶解有式(4)所示的2’-ome-u酰胺的混合液中包含的乙腈与式(3)所示的芳香族系烃的体积比率以乙腈：式(3)所示的芳香族系烃计为90：10～10：90。
6.如权利要求1～3中任一项所述的寡核苷酸的制造方法，其中，溶解有式(4)所示的2’-ome-u酰胺的混合液中包含的乙腈与式(3)所示的芳香族系烃的体积比...
【专利技术属性】
技术研发人员：竹下玲央，加纳俊史，田中雄树，
申请(专利权)人：住友化学株式会社，
类型：发明
国别省市：
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