【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种工程化的自然杀伤细胞，尤其涉及一种具有增强的肿瘤杀伤性能的自然杀伤细胞，包含所述细胞的药物组合物及其应用。
技术介绍
1、近年来，随着car-t免疫细胞的兴起，越来越多的研究者逐渐关注到免疫细胞治疗领域，采用免疫细胞来进行肿瘤治疗也取得了突破性的进展，其中嵌合抗原受体无疑成为了众多研究的焦点。嵌合抗原受体，又称car(chimeric antigen receptor)，是可以识别特定蛋白的细胞表面受体，表达于细胞表面。嵌合抗原受体从结构上一般包括胞外域、跨膜区和胞内信号转导区，其中胞外域含有抗原结合部位，用于识别特定的抗原或蛋白质，通常是一个抗体来源的scfv分子，将其通过铰链区连接到跨膜区域；跨膜区是用于将car固定在细胞膜上，起到稳定car分子的作用；胞内信号转导区通常含有信号转导结构和共刺激结构，胞内信号转导区负责对细胞进行信号传递和刺激活化。
2、car19是靶向cd19抗原的嵌合抗原受体，用于靶向表达cd19分子的细胞，例如b细胞恶性肿瘤等。nk细胞，即自然杀伤性细胞，car19-nk细胞是表面表达靶向cd19抗原的嵌合抗原受体的nk细胞。car-nk细胞与car-t细胞存在较大的不同，car-t细胞在治疗过程中往往存在较为严重的不良反应，例如细胞因子风暴，产生大量炎症因子(含il-6等)，破坏神经系统，产生神经毒性，以及移植物抗宿主病等，更为严重的，偶有因car-t细胞治疗导致的死亡事件发生；而car-nk细胞相对安全的多，通常不发生移植物抗宿主病，不产生细胞因子风暴，仅分泌少量的if
3、在现有技术中，car-t细胞往往都是采用病毒转导的方式制备而成，例如现有技术文件cn109735558a，其使用慢病毒转导系统制备了car-t细胞。然而虽然慢病毒转导是细胞内基因修饰和传递的常用方法之一，但病毒转导存在免疫排斥反应，易造成不可预期的排异问题，同时病毒会造成基因组的随机整合，稳定性差，风险高；另外，对于nk细胞而言，其对慢病毒具有抗性，这使得基于慢病毒转导的car-nk细胞具有较低的转导效率，且依赖于促进慢病毒转导效率的化学试剂，而所用的化学试剂往往对nk细胞会产生相当的毒性，不利于car-nk细胞的制备。
4、il-24，即白细胞介素24，其属于il-10白介素家族，il-24可激活p38mapk信号通路促进黑色素瘤肿瘤细胞的凋亡，同时其也被用于car-t细胞中，增强t细胞的增殖活化，能够增强car-t产品的治疗潜能。然而由于nk细胞和t细胞对肿瘤细胞的作用机理存在较多不同之处，其提高增殖能力的原理也不相同，目前尚没有证据或报道表示il-24能够应用于car-nk细胞，以增强nk的杀伤作用及增殖能力。
5、因此如何克服慢病毒所带来的不利影响，并提高car19-nk细胞的抗肿瘤能力是本领域技术人员需要解决的问题之一。
技术实现思路
1、为了克服慢病毒转导系统存在的问题，以及提高car19-nk细胞的抗肿瘤能力，本专利技术的专利技术人采用非病毒载体转导的定点整合，在car19-nk细胞的基因组中进一步引入编码il-24的基因。本专利技术的专利技术人经过大量实验，获得一种同时表达car19和il-24的工程化自然杀伤细胞，并意外发现，所述工程化自然杀伤细胞具有显著增强的肿瘤杀伤性能。
2、在第一个方面，本专利技术提供一种工程化自然杀伤细胞，其中，所述工程化自然杀伤细胞的基因组中整合有编码car19的多核苷酸和编码il-24的多核苷酸，并且所述工程化自然杀伤细胞同时表达car19和il-24。
3、在本专利技术的一些实施方案中，所述多核苷酸定点整合在所述自然杀伤细胞的基因组中，所述定点整合位点位于基因组的核糖体rna转录区(rdna区)，例如5s rrna、5.8srrna、18s rrna或28s rrna的转录区，优选地，所述定点整合位点位于18s rrna的转录区，更优选地，所述定点整合位点位于18s rrna转录区的5468位点。
4、在本专利技术的一些实施方案中，所述编码car19的多核苷酸和所述编码il-24的多核苷酸位于同一条多核苷酸链。
5、在本专利技术的一些实施方案中，所述编码car19的多核苷酸和所述编码il-24的多核苷酸之间存在其他多核苷酸片段，例如，所述编码car19的多核苷酸和所述编码il-24的多核苷酸之间存在编码2a肽的多核苷酸，优选地，所述2a肽选自p2a、t2a、e2a和f2a，更优选地，所述2a肽为t2a，其氨基酸序列如seq id no:1所示。现有技术已知的其他能够导致car19和il-24同时产生的序列也可应用于本专利技术，例如ires序列。在一些实施方案中，car19和il-24在一个表达框内以多顺反子形式存在并表达，或者在独立的表达框表达。两者可以在一个载体，也可以在不同的载体。
6、在本专利技术的一些实施方案中，所述car19是靶向cd19抗原的嵌合抗原受体，优选地，所述car19的氨基酸序列如seq id no:4所示。
7、在本专利技术的一些实施方案中，所述il24是经修饰或未经修饰的il24，优选地，所述il-24的氨基酸序列如seq id no:2所示。
8、在本专利技术的一些实施方案中，定点整合入自然杀伤细胞基因组的核苷酸片段编码：位于胞外区的特异性识别肿瘤抗原cd19的抗体的抗原结合部分，跨膜区和位于胞内区的cd28胞浆功能区及cd3zeta胞浆功能区，以及可以自分泌的il-24。优选地，所述核苷酸片段序列如seq id no：6所示。
9、在本专利技术的一些实施方案中，所述自然杀伤细胞是由外周血分离的自然杀伤细胞经工程化而获得，或由骨髓、脐血或外周血来源的祖细胞经工程化分化而来，或由多能干细胞经工程化分化而来，优选地，所述自然杀伤细胞是由多能干细胞经工程化分化而来，更优选地，所述自然杀伤细胞是由诱导多能干细胞经工程化分化而来。
10、在第二个方面，本专利技术提供一种构建如第一方面所述的工程化自然杀伤细胞的方法，包括在细胞的基因组中整合编码car19的多核苷酸和编码il-24的多核苷酸，所述整合通过基因编辑系统进行，不使用病毒。
11、在本专利技术的一些实施方案中，所述基因编辑系统选自cre-lox系统、zinc fingernucleases(zfns)、crispr-cas9或transcription activator-like effector nucleases(talens)，优选为crispr-cas9或talens。
12、在本专利技术的一些实施方案中，所述细胞为自然杀伤细胞或多能干细胞，优选为多能干细胞，更优选为诱导多能干细胞。
13、在第三个方面，本专利技术提供一种将多能干细胞定向分化为自本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种工程化自然杀伤细胞，其中，所述工程化自然杀伤细胞的基因组中整合有编码CAR19的多核苷酸和编码IL-24的多核苷酸，并且所述工程化自然杀伤细胞同时表达CAR19和IL-24。
2.根据权利要求1所述的工程化自然杀伤细胞，其中，所述多核苷酸定点整合在所述自然杀伤细胞的基因组中，所述定点整合位点位于基因组的核糖体RNA转录区(rDNA区)，例如5S rRNA、5.8S rRNA、18S rRNA或28S rRNA的转录区，优选地，所述定点整合位点位于18SrRNA的转录区，更优选地，所述定点整合位点位于18S rRNA转录区的5468位点。
3.根据权利要求1或2所述的工程化自然杀伤细胞，其中，所述编码CAR19的多核苷酸和所述编码IL-24的多核苷酸位于同一条多核苷酸链。
4.根据权利要求3所述的工程化自然杀伤细胞，其中，所述编码CAR19的多核苷酸和所述编码IL-24的多核苷酸之间存在编码2A肽的多核苷酸，优选地，所述2A肽选自P2A、T2A、E2A和F2A，更优选地，所述2A肽为T2A，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。>
5.根据权利要求1至4任一所述的工程化自然杀伤细胞，其中，所述CAR19是靶向CD19抗原的嵌合抗原受体，优选地，所述CAR19的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
6.根据权利要求1至5任一所述的工程化自然杀伤细胞，其中，所述IL24是经修饰或未经修饰的IL24，优选地，所述IL-24的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
7.根据权利要求1至6任一所述的工程化自然杀伤细胞，其中，所述自然杀伤细胞是由外周血分离的自然杀伤细胞经工程化而获得，或由骨髓、脐血或外周血来源的祖细胞经工程化分化而来，或由多能干细胞经工程化分化而来，优选地，所述自然杀伤细胞是由多能干细胞经工程化分化而来，更优选地，所述自然杀伤细胞是由诱导多能干细胞经工程化分化而来。
8.一种构建根据权利要求1至7任一所述的工程化自然杀伤细胞的方法，包括在细胞的基因组中整合编码CAR19的多核苷酸和编码IL-24的多核苷酸，所述整合通过基因编辑系统进行，不使用病毒。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述基因编辑系统选自Cre-lox系统、ZincFinger Nucleases(ZFNs)、CRISPR-Cas9或Transcription Activator-Like EffectorNucleases(TALENs)，优选为CRISPR-Cas9或TALENs。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中，所述细胞为自然杀伤细胞或多能干细胞。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述细胞为多能干细胞，优选地，所述多能干细胞为诱导多能干细胞。
12.一种将多能干细胞定向分化为自然杀伤细胞的方法，包括以下步骤：
13.根据权利要求12所述的方法，其中，Chroman 1、Emricasan和Trans-ISRIB分子的体积摩尔浓度比为1:80～120:10～15。
14.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至7任一所述的工程化自然杀伤细胞或根据权利要求8至13任一所述的方法构建的工程化自然杀伤细胞，以及药学上可接受的载体。
15.根据权利要求1至7任一所述的工程化自然杀伤细胞、根据权利要求8至13任一所述的方法构建的工程化自然杀伤细胞或根据权利要求14的药物组合物在制备治疗肿瘤或自体免疫疾病的药物中的用途。
16.根据权利要求15所述的用途，其中，所述肿瘤选自晚期或难治性肝细胞癌、结直肠癌、非小细胞肺癌、三阴性乳腺癌、胃癌、胃食管交界处腺癌、胆管癌、尿路上皮癌和食管方形细胞癌、脑肿瘤、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、输卵管癌、前列腺癌、宫颈癌、甲状腺癌、鼻咽癌、胶质母细胞瘤、结直肠腺癌、垂体瘤、垂体腺瘤、垂体大腺瘤、妊娠滋养细胞肿瘤、绒癌、胎盘部位滋养细胞肿瘤、上皮样滋养细胞肿瘤、肾细胞癌、黑色素瘤、骨髓瘤、淋巴瘤、肺腺癌和胶质肉瘤。
...【技术特征摘要】
1.一种工程化自然杀伤细胞，其中，所述工程化自然杀伤细胞的基因组中整合有编码car19的多核苷酸和编码il-24的多核苷酸，并且所述工程化自然杀伤细胞同时表达car19和il-24。
2.根据权利要求1所述的工程化自然杀伤细胞，其中，所述多核苷酸定点整合在所述自然杀伤细胞的基因组中，所述定点整合位点位于基因组的核糖体rna转录区(rdna区)，例如5s rrna、5.8s rrna、18s rrna或28s rrna的转录区，优选地，所述定点整合位点位于18srrna的转录区，更优选地，所述定点整合位点位于18s rrna转录区的5468位点。
3.根据权利要求1或2所述的工程化自然杀伤细胞，其中，所述编码car19的多核苷酸和所述编码il-24的多核苷酸位于同一条多核苷酸链。
4.根据权利要求3所述的工程化自然杀伤细胞，其中，所述编码car19的多核苷酸和所述编码il-24的多核苷酸之间存在编码2a肽的多核苷酸，优选地，所述2a肽选自p2a、t2a、e2a和f2a，更优选地，所述2a肽为t2a，其氨基酸序列如seq id no:1所示。
5.根据权利要求1至4任一所述的工程化自然杀伤细胞，其中，所述car19是靶向cd19抗原的嵌合抗原受体，优选地，所述car19的氨基酸序列如seq id no:4所示。
6.根据权利要求1至5任一所述的工程化自然杀伤细胞，其中，所述il24是经修饰或未经修饰的il24，优选地，所述il-24的氨基酸序列如seq id no:2所示。
7.根据权利要求1至6任一所述的工程化自然杀伤细胞，其中，所述自然杀伤细胞是由外周血分离的自然杀伤细胞经工程化而获得，或由骨髓、脐血或外周血来源的祖细胞经工程化分化而来，或由多能干细胞经工程化分化而来，优选地，所述自然杀伤细胞是由多能干细胞经工程化分化而来，更优选地，所述自然杀伤细胞是由诱导多能干细胞经工程化分化而来。
8.一种构建根据权利要求1至7任一所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：梁德生，胡乾，张昱萱，邬玲仟，
申请(专利权)人：上海苹谱医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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