【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及基于金胶和纳米酶的双比色生物传感器同时检测两种mirnas的方法。
技术介绍
1、肿瘤标志物是出现在血液和组织中与肿瘤有关的分子，找到一种早期灵敏检测肿瘤标志物的方法对肿瘤诊断和治疗至关重要。近年来，相关研究表明mirna是一种肿瘤早期筛查的生物标志物，它们的异常表达水平与肿瘤的发生和发展密切相关。为了进一步提高检测的灵敏度以实现肿瘤早期诊断，人们建立了一系列基于核酸信号放大的检测方法。根据酶的参与与否，信号放大方式可分为基于酶介导的信号放大和无酶介导的信号放大两类。基于酶介导的信号放大技术中所用酶的价格昂贵，保存时间较短，且酶活性易受环境影响。而基于杂交链式反应（hcr）、催化发卡自组装反应（cha）的信号放大因无需酶催化、无需专业技术人员及扩增设备、常温下可发生反应、操作简便、选择性多、反应稳定、检测特异性强以及灵敏度高等优点，被广泛用于mirnas的灵敏检测。
2、尽管无酶介导的信号放大策略显著提高了检测的灵敏度，但是这些检测技术仍然需要借助复杂昂贵的仪器设备输出检测信号。而比色生物传感技术无需昂贵而精密的仪器设备，具有成本低、简易、实用性等优点。此外，目前大多数诊断方法往往只针对单个肿瘤标志物的检测，这导致可能存在假阳性信号，致使肿瘤诊断的准确度不高。因此，发展一种能够同时检测多个肿瘤相关mirnas的简易比色诊断方法具有重要意义。
技术实现思路
1、专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是提供一种基于金胶（gnps）和纳米酶的双
2、技术方案：为了解决上述技术问题，本专利技术提供了基于gnps和纳米酶的双比色生物传感器同时检测两种肿瘤标志物的方法。所述分析方法包括如下步骤：首先，所制备的dna功能化gnps、dna功能化磁珠、发卡dna与待测样品充分混合并孵育；经磁分离后，得到上层红色澄清溶液和磁珠沉淀物；进一步地，向磁珠沉淀物中加入k+、hemin以及h2o2/abts等催化底物溶液，混合后进行孵育反应，经磁分离步骤后得到绿色澄清溶液；最后，通过肉眼观察或uv- vis光谱仪测定所收集的两种不同颜色澄清溶液得出两种肿瘤标志物的浓度。
3、优选地，所述gnps浓度为13 nm，粒径为10~50 nm。
4、优选地，所述dna功能化gnps的制备方法，包括以下步骤：向gnps中加入sh-10b的dna溶液，混合震荡孵育10~30 min；接下来，向上述溶液中加入pb缓冲液，震荡孵育10~30min；随后，每隔20 min向金胶溶液中加入2 mol/l的nacl溶液进行老化反应，直至nacl溶液达到500 mm，继续将该混合溶液置于摇床振荡过夜反应，最终，采用pbs缓冲液离心分离洗涤gnps得到10b-dna功能化gnps。
5、优选地，所述pb缓冲溶液为：10 mm nah2po4、2.7 mm kcl、2 mm kh2po4，ph 7.0~7.5；pbs缓冲溶液为：137 mm nacl、10 mm nah2po4、2.7 mm kcl、2 mm kh2po4，ph 7.0~7.5。
6、优选地，所述磁珠浓度为0.2~1 mg/l，粒径为0.2~1 μm。
7、优选地，所述sh-10b的dna浓度为25 nm~100 nm。
8、优选地，所述dna功能化磁珠的制备方法，包括以下步骤：向链霉亲和素修饰磁珠溶液中加入bio-h0和bio-10b的dna溶液，并置于25~40oc摇床震荡孵育15~60分钟；最后，利用磁分离技术进行分离并去除上清，使用tris缓冲液对磁珠进行洗涤，以充分去除多余dna，最终得到bio-h0和bio-10b共修饰磁珠。
9、优选地，所述链霉亲和素修饰磁珠溶液为：10 mm tris-hcl，ph 7.0~8.0，且含有1mm edta、1 mol/l nacl和0.1%吐温-20。
10、优选地，所述bio-h0和bio-10b的dna溶液的浓度均为500 nm~1 μm。
11、优选地，所述tris缓冲液为：20 mm tris-hcl，ph 7.0~8.0，0.1%吐温-20。
12、优选地，本专利技术所述的待测样品是肿瘤诊断中的mirnas生物标志物。
13、优选地，本专利技术所述的孵育反应，反应温度为25~40oc，孵育时间为0.5~2小时。
14、优选地，本专利技术所述的上层红色澄清溶液，通过肉眼观察该溶液的颜色深浅或uv- vis测定该溶液在520 nm处的吸光值，实现样品中一种mirna的半定量/定量检测。
15、优选地，本专利技术所述的催化反应步骤为：将磁分离后的磁珠沉淀物重新悬浮于mes缓冲溶液中，在磁珠混合液中加入hemin水溶液，并置于37oc孵育0.5~1 h，随后，加入h2o2/abts水溶液，继续孵育反应10~30 min，最后，采用磁分离技术分离磁珠，收集上层绿色澄清溶液。通过肉眼观察该溶液的颜色或uv- vis测定该溶液在420 nm处的吸光值，实现样品中另一mirna的半定量/定量检测。
16、优选地，所述mes缓冲液的成分中含有nacl、kcl、dmso和吐温-20。mes缓冲液的浓度为10~100 mm，ph为4.0~60，kcl浓度为10~150mm，dmso含量为1%，吐温-20含量为0.1%。
17、优选地，所述hemin的终浓度为1~4 μm。
18、优选地，所诉h2o2/abts终浓度为1~5 mm。
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1.一种基于GNPs和纳米酶的双比色生物传感器同时检测两种miRNAs的方法，其特征在于，包括基于金胶（GNPs）和纳米酶的双比色生物传感器同时检测两种miRNAs的方法。
2.根据权利要求1所述的基于GNPs和纳米酶的双比色生物传感器同时检测两种miRNAs的方法，其特征在于，所制备的DNA功能化GNPs、DNA功能化磁珠、发卡DNA与待测样品充分混合并孵育，经磁分离后，得到上层红色澄清溶液和磁珠沉淀物，进一步地，向磁珠沉淀物中加入K+、Hemin以及H2O2/ABTS等催化底物溶液，混合后进行孵育反应，经磁分离步骤得到绿色澄清溶液。
3.根据权利要求2所述的基于GNPs和纳米酶的双比色生物传感器同时检测两种miRNAs的方法，其特征在于，所述GNPs粒径为10~50 nm。
4.根据权利要求2所述的基于GNPs和纳米酶的双比色生物传感器同时检测两种miRNAs的方法，其特征在于，所述DNA功能化GNPs的制备采用巯基化DNA与GNPs偶联得到；偶联反应温度为25~40 oC；反应时间为8~24小时。
5.根据权利要求2所述的基于
6.根据权利要求2所述的基于GNPs和纳米酶的双比色生物传感器同时检测两种miRNAs的方法，其特征在于，所述DNA功能化磁珠的制备采用生物素化DNA与链霉亲和素修饰磁珠偶联得到；偶联缓冲液为10 mM Tris-HCl，pH 7.0~8.0，且含有1 mM EDTA、1 mol/L NaCl和0.1%吐温-20；偶联反应温度为25~40 oC；反应时间为15~60分钟。
7.根据权利要求2所述的基于GNPs和纳米酶的双比色生物传感器同时检测两种miRNAs的方法，其特征在于，所述待测样品是肿瘤诊断中两种miRNAs的生物标志物。
8.根据权利要求2所述的基于GNPs和纳米酶的双比色生物传感器同时检测两种miRNAs的方法，其特征在于，所述孵育反应的温度为25~40 oC，孵育时间为0.5~2小时。
9.根据权利要求2所述的基于GNPs和纳米酶的双比色生物传感器同时检测两种miRNAs的方法，其特征在于，所述催化底物溶液的关键成分为MES缓冲液，且含有NaCl，KCl，Hemin，H2O2、ABTS、DMSO和吐温-20。
10.根据权利要求2所述的基于GNPs和纳米酶的双比色生物传感器同时检测两种miRNAs的方法，其特征在于，所述催化底物溶液，MES缓冲液的浓度为10~100 mM，pH为4.0~60，KCl浓度为10~150 mM，Hemin浓度为1~4 μM，H2O2/ABTS浓度为1~5 mM。
...【技术特征摘要】
1.一种基于gnps和纳米酶的双比色生物传感器同时检测两种mirnas的方法，其特征在于，包括基于金胶（gnps）和纳米酶的双比色生物传感器同时检测两种mirnas的方法。
2.根据权利要求1所述的基于gnps和纳米酶的双比色生物传感器同时检测两种mirnas的方法，其特征在于，所制备的dna功能化gnps、dna功能化磁珠、发卡dna与待测样品充分混合并孵育，经磁分离后，得到上层红色澄清溶液和磁珠沉淀物，进一步地，向磁珠沉淀物中加入k+、hemin以及h2o2/abts等催化底物溶液，混合后进行孵育反应，经磁分离步骤得到绿色澄清溶液。
3.根据权利要求2所述的基于gnps和纳米酶的双比色生物传感器同时检测两种mirnas的方法，其特征在于，所述gnps粒径为10~50 nm。
4.根据权利要求2所述的基于gnps和纳米酶的双比色生物传感器同时检测两种mirnas的方法，其特征在于，所述dna功能化gnps的制备采用巯基化dna与gnps偶联得到；偶联反应温度为25~40 oc；反应时间为8~24小时。
5.根据权利要求2所述的基于gnps和纳米酶的双比色生物传感器同时检测两种mirnas的方法，其特征在于，所述磁珠粒径为0.2~1 μm。
6.根据权利要求2所述的基于gnps和纳米酶的双比色生物传感器同时检测两种mi...
【专利技术属性】
技术研发人员：苏娟，葛炜民，赵兴琦，丁蕊，周毅，
申请(专利权)人：南京科技职业学院，
类型：发明
国别省市：
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