【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及对至少一种感兴趣的跨膜蛋白(tp)的至少一种配体的高通量筛选(hts)，所述跨膜蛋白(tp)嵌入在至少一个来源于植物性内质网(er)的内源性微粒体的脂质双层中，所述高通量筛选包括以下步骤：提供包含至少一种嵌入在脂质双层中的tp的至少一个内源性微粒体，或者包含至少一种嵌入在脂质双层中的tp的至少一个内源性微粒体片段；提供至少一种感兴趣的分析物；使至少一种tp与至少一种分析物接触；以及检测所述至少一种分析物与所述至少一种tp之间的相互作用。所述筛选适用于高多重等级的tp和分析物，以及适用于快速且可重复地鉴定作为潜在候选药物的配体。此外，本专利技术还提供用于高通量筛选的所有基本产品、耗材和试剂盒。因此，本专利技术涉及对与导致或参与疾病的信号传导相关的tp的生化和生物技术候选药物筛选的。
技术介绍
1、目前，作为概念验证，基于来源于烟草(nicotiana tabacum)by-2细胞的裂解物的无细胞(cf)系统(含有称为的内源性微粒体)用于tp生产。使用palice02载体(leniobio gmbh)在中表达三种充分表征的tp：hegf、pvr、tigit和ace2。此外，c末端有标签的tp用于根据本专利技术所述的hts的概念验证，并且微粒体被捕获。一旦tp被捕获，进行tp及其各自配体的相互作用(结合)测定。被证明是成功的cf系统，用于i型跨膜蛋白pvr、tigit和ace2的生产。这些蛋白质的表达有助于研究蛋白质定向(proteinorientation)和结构的测定的设计。此外，pvr和ace2正确折叠以及结合测定
2、药物发现是艰巨、昂贵且耗时的过程。研发新药的平均时间为10-15年，并且它可能需要高达8亿欧元。sars-cov-2大流行病表明，这个过程需要加快，以便在未来几年快速应对新的大流行病的威胁。基于靶点的药物发现是新药研发的最常见策略。传统上，最遵循的范式是一种药物对一个靶点，但对于允许针对一个靶点筛选多种药物的平台的需求已经变得至关重要。用于药物发现的配体筛选对于新药的研发至关重要。目前，药物发现有两种主要方法，即基于靶点的筛选或表型筛选。表型筛选基于试图鉴定可以改变细胞表型至需要的结果的分子，而基于靶点的筛选基于使用重组技术寻找在疾病中发挥作用的靶点。自20世纪90年代以来，高通量筛选(hts)是聚焦靶点的筛选，越来越多地被大多数制药公司用于发现新药。例如，hts频繁用于研究针对神经退行性疾病的潜在药物。hts基于对多个分子/化合物或针对一个已知靶点的“命中”的筛选。hts的日益增加的使用已经取代了通常使用的慢节奏“试错”技术，以建立更快的方法。然而，现有技术筛选方法的通量是有限的，这表明存在以更高通量研发下一代药物筛选平台以提高药物发现速度的需求。hts的主要特征是药物发现的靶点是已知的，并且作用在靶点上的多个分子的测试可以作为潜在药物进行分析。药物靶点可以是在具体的疾病过程中发挥作用的小分子或任何种类的蛋白质，并且可以通过治疗这种疾病的药物来解决。因此，制药工业依赖于“命中”与靶点的选择性结合或者导致靶点调控的特异性相互作用。
3、然而，hts存在一些限制，这些限制会阻止其充分发挥潜力，特别是针对跨膜蛋白(tp)候选药物的hts，tp构成了大多数药物靶点，但与胞浆蛋白相比代表性不足。目前，超过60％的现有药物靶点是跨膜蛋白(tp)。tp参与确保细胞的结构和功能完整性的重要生理机制。对于细胞识别、免疫反应、信号转导和分子运输等许多过程，tp是关键组分。tp的使用构成了药物研发的一个问题，因为hts期间的表达、翻译后修饰(ptm)、蛋白质折叠和稳定是困难的。
4、tp占人类编码的总蛋白质的30％，但它们目前没有得到良好地表征。tp很难在活的真核细胞中产生。研究中的主要问题之一是tp的过表达对真核细胞健康有很强的有害影响，从而阻碍了经正确折叠和生理功能性的tp的产生。这种蛋白质的产生的限制是导致tp的功能和结构特征延迟的原因。此外，原核细胞不适合真核tp的产生，并且这些蛋白质的表达会导致蛋白质聚集体的形成，所述蛋白质聚集体表达后需要溶解(sachse等人，2013)。然而，还有其他蛋白质表达平台可以以简单的方式(khambhati等人，2019)生产多种类型的蛋白质，而不依赖于细胞的结构完整性。这些平台是基于无细胞蛋白合成(cfps)。
5、无细胞蛋白质合成(cpsf)系统个基于粗裂解物，所述粗裂解物含有翻译、蛋白质折叠和能量代谢所必需的机制(buntru等人，2014)。cfps是有前景的蛋白质生产解决方案，可实现更短的过程时间和更少的蛋白质水解。cfps的一个主要优点是能够表达细胞毒性蛋白(khambhati等人，2019)，在合成难以表达的蛋白质(特别地是tp)方面做出了重大贡献。cfps有许多变化，由重组转录-翻译机制组成，或者来源于原核或真核细胞裂解物。最常用的裂解物是大肠杆菌(escherichia coli)提取物(ece)、兔网织红细胞裂解物(rrl)、中国仓鼠卵巢细胞(cho)裂解物、小麦胚芽(wge)裂解物和昆虫细胞提取物(ice)。然而，目前使用的主要cfps平台并不完全理想，总体蛋白质生产产量低，生产时间慢，不可用或不适当的蛋白质修饰，并且对于tp的生物合成不可行或不够可行。为了解决其中的一些问题，buntru等人(2014)研发了使用烟草by-2(bright yellow-2)细胞的无细胞系统，所述系统在更短的时间内展现出更高的蛋白质产量。但目前尚无用于可获取且功能性的tp候选药物的hts。
6、细胞膜提供的复杂性和屏障引发了许多困难，例如实验难以标准化、不相容性问题和可变性。为了克服tp生物合成和tp供应的挑战，现有技术使用活细胞或人工组分，例如合成的脂质与原核系统(例如大肠杆菌提取物(ece))的组合，以获得经正确折叠、经修饰和稳定的tp。这样做，无法克服上述缺点，并且生物合成更复杂、更耗时且更昂贵，获得所期望的tp的产量较低。
7、为了解决这些问题，本专利技术的一个目的是提供一种真核系统(优选地是植物无细胞蛋白质合成(cfps)系统)作为适合于在不使用活细胞且无人工组分的情况下工作的关键工具，用于经正确折叠、经修饰和稳定的tp的合成。嵌入在内源性微粒体脂质双层中的tp的供应能够为作为tp的候选药物的配体提供本专利技术的hts平台。
技术实现思路
1、因此，本专利技术的一个目的是提供用于合成嵌入在源自内源性微粒体的脂质双层中的tp的方法，并提供嵌入在所述脂质双层中的感兴趣的tp，用于对配体的筛选，特别地是作为候选药物的配体。另一个目的是提供稳定且经正确折叠的感兴趣的tp，所述tp嵌入在源自内源性微粒体的脂质双层中。此外，本专利技术的目的是提供包含至少一种嵌入在所述脂质双层中的tp的内源性微粒体或其片段。本专利技术的另一个目的是提供嵌入在所述脂质双层中的tp，所述tp被捕获到表面上，用于后续的筛选和检测相本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.对至少一种感兴趣的跨膜蛋白(TP)的至少一种配体的高通量筛选，所述跨膜蛋白(TP)嵌入在至少一个来源于植物性内质网(ER)的内源性微粒体的脂质双层中，所述高通量筛选包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的筛选，其中所述至少一个微粒体或微粒体片段来源于茄科(Solanaceae)烟草属(Nicotiana)。
3.根据权利要求1或2所述的筛选，其中执行将嵌入在微粒体或微粒体片段的脂质双层中的至少一种TP捕获至生物非活性表面的步骤。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的筛选，其中嵌入在所述内源性微粒体和/或所述内源性微粒体片段的脂质双层中的至少一种TP被捕获至生物非活性表面上。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的筛选，其中所述生物非活性表面是包括微颗粒、纳米颗粒和磁性颗粒的颗粒的表面，包括微量滴定板、微流控装置、微阵列、微芯片的装置的表面，和/或所述生物非活性表面是适合于捕获至少一种感兴趣的TP的任何其他表面。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的筛选，其中所述至少一种TP包含在C末端和/或N末端的至少一种标签。>
7.根据权利要求1至6中任一项所述的筛选，其中所述至少一种分析物包括小分子、肽、多肽、可溶性蛋白、膜蛋白、蛋白质复合物或上述的任意组合。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的筛选，其中所述筛选是对至少一种感兴趣的TP的至少一种配体的多重高通量筛选，同时提供在两个或更多个反应区中的两种或更多种分析物，和/或同时提供在两个或更多个反应区中的两种或更多种分析物的分析物组合。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的筛选，其中通过免疫测定、光谱测定、颗粒大小测量、磁性测量和/或光学测量来检测所述至少一种TP与所述至少一种分析物之间的相互作用。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的筛选，其中至少一个来源于植物性内质网的内源性微粒体或内源性微粒体片段来自茄科烟草属植物的细胞裂解物。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的筛选，其中所述裂解物来自烟草(Nicotianatabacum)的BY-2细胞系。
12.至少一种感兴趣的跨膜蛋白(TP)的无细胞生产，所述跨膜蛋白(TP)嵌入在至少一个来源于植物性内质网(ER)的内源性微粒体的脂质双层中，所述无细胞生产包括以下步骤：
13.根据权利要求12所述的方法，其中执行将至少一种嵌入在微粒体的脂质双层中的TP捕获到至少一个生物非活性表面上的步骤。
14.根据权利要求13所述的方法，其中执行捕获步骤，并处理至少一个被捕获的微粒体以获得微粒体片段，其中所述至少一种TP保持嵌入在脂质双层中。
15.根据权利要求13所述的方法，其中处理至少一个游离微粒体，以获得游离微粒体片段，其中所述至少一种TP保持嵌入在脂质双层中，并且将所述至少一种嵌入在微粒体的脂质双层中的TP捕获到所述至少一个生物非活性表面上。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的方法，其中所述生物非活性表面是包括微颗粒、纳米颗粒和磁性颗粒的颗粒的表面，包括微量滴定板、微流控装置、微阵列、微芯片的装置的表面，和/或所述生物非活性表面是适合于捕获至少一种感兴趣的TP的任何其他表面。
17.根据权利要求12至16中任一项所述的方法，其中所述至少一个微粒体或微粒体片段来源于茄科烟草属。
18.来源于植物性内质网(ER)的内源性微粒体或至少一个内源性微粒体片段，所述内源性微粒体或内源性微粒体片段包含至少一种嵌入在脂质双层中的感兴趣的跨膜蛋白(TP)。
19.包含至少一种捕获的感兴趣的TP的生物非活性表面，所述感兴趣的TP嵌入在来源于植物性内质网(ER)的至少一个内源性微粒体或至少一个内源性微粒体片段的脂质双层中，其中所述生物非活性表面是耗材的表面。
20.用于对至少一种感兴趣的跨膜蛋白(TP)的至少一种配体的高通量筛选的试剂盒，所述感兴趣的跨膜蛋白(TP)嵌入在来源于植物性内质网(ER)的至少一个内源性微粒体的脂质双层中，所述内源性微粒体优选地来源于茄科烟草属植物，所述试剂盒包含：
21.根据权利要求20所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含耗材，所述耗材包含生物非活性表面、由生物非活性表面组成或者涂有生物非活性表面，所述生物非活性表面用于将所述至少一种嵌入在微粒体的脂质双层中的TP捕获到所述生物非活性表面。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.对至少一种感兴趣的跨膜蛋白(tp)的至少一种配体的高通量筛选，所述跨膜蛋白(tp)嵌入在至少一个来源于植物性内质网(er)的内源性微粒体的脂质双层中，所述高通量筛选包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的筛选，其中所述至少一个微粒体或微粒体片段来源于茄科(solanaceae)烟草属(nicotiana)。
3.根据权利要求1或2所述的筛选，其中执行将嵌入在微粒体或微粒体片段的脂质双层中的至少一种tp捕获至生物非活性表面的步骤。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的筛选，其中嵌入在所述内源性微粒体和/或所述内源性微粒体片段的脂质双层中的至少一种tp被捕获至生物非活性表面上。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的筛选，其中所述生物非活性表面是包括微颗粒、纳米颗粒和磁性颗粒的颗粒的表面，包括微量滴定板、微流控装置、微阵列、微芯片的装置的表面，和/或所述生物非活性表面是适合于捕获至少一种感兴趣的tp的任何其他表面。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的筛选，其中所述至少一种tp包含在c末端和/或n末端的至少一种标签。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的筛选，其中所述至少一种分析物包括小分子、肽、多肽、可溶性蛋白、膜蛋白、蛋白质复合物或上述的任意组合。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的筛选，其中所述筛选是对至少一种感兴趣的tp的至少一种配体的多重高通量筛选，同时提供在两个或更多个反应区中的两种或更多种分析物，和/或同时提供在两个或更多个反应区中的两种或更多种分析物的分析物组合。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的筛选，其中通过免疫测定、光谱测定、颗粒大小测量、磁性测量和/或光学测量来检测所述至少一种tp与所述至少一种分析物之间的相互作用。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的筛选，其中至少一个来源于植物性内质网的内源性微粒体或内源性微粒体片段来自茄科烟草属植物的细胞裂解物。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的筛选，其中所述裂解物来自烟草(nicotianatabacum)的by-2细胞系。
12.至少一种感兴趣的跨膜蛋白(tp...
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