【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学检测，具体涉及一种多重防污染pcr预混液及其在大熊猫性别鉴定中的应用。
技术介绍
1、大熊猫（ailuropoda melanoleuca）是我国特有的濒危珍稀保护动物，也是世界生物多样性保护的旗舰物种。但在野生大熊猫种群性别比例调查和圈养大熊猫个体针对性饲养管理上，准确鉴定大熊猫性别一直是一个难题。一方面由于野生大熊猫不容易被近距离仔细观察，研究人员很难通过其行为表现来判断性别。另一方面大熊猫被毛浓密而且没有明显的第二性征，研究人员不能通过外表特征区别雌雄个体。幼龄大熊猫具有雌雄生殖器外形差异不明显的生理特点，因此更难以在早期阶段准确判断出幼龄个体的性别。综合动物行为、外表及生殖器特征来鉴定性别的方法不仅准确性较低，而且严重依赖于操作人员的主观经验。随着分子生物学技术的发展，pcr检测为鉴定大熊猫性别提供了可靠办法。zhan等开发了两对被收录在《大熊猫种群遗传档案建立技术规程》(中华人民共和国林业行业标准ly/t 2896-2017)中的组合引物，专门用于大熊猫性别鉴定。一对是扩增y染色体sry基因的zx1引物（zx1-f: 5’-ctacatagccccaaccccttttc-3’ ； zx1-r: 5’-ggttctggccgctgtctctactat-3’），目的片段大小为210bp，用于鉴定雄性个体。另一对是扩增x染色体zfx基因的zfx引物（zfx-f: 5’-ataatcacatggagagccacaagct-3’ ； zfx-r: 5’-ctcctttttccttatgcacc-3’），目
2、大熊猫性别鉴定的dna来源通常是排泄物等非损伤性样本，或者组织、血液等损伤性样本，其中非损伤性的粪便样本是最常见的选择。pcr扩增效果容易受dna中各类抑制物的不利影响。虽然《大熊猫种群遗传档案建立技术规程》(中华人民共和国林业行业标准ly/t 2896—2017)推荐在pcr体系中添加牛血清白蛋白（bsa）以结合dna中的某些抑制物，但是依靠单一pcr辅剂仍不足以避免非特异性扩增增加或taq酶活性受抑现象。粪便dna不仅含有大量易导致非特异性扩增的背景dna（除宿主dna以外来自微生物、食物等物质的dna），而且容易残留各种破坏pcr体系稳定性的扩增抑制物，会使非特异性扩增增多、目的条带亮度减弱，甚至导致扩增失败。因此，若要获得稳定可靠的性别鉴定结果，则必须增加pcr辅剂种类来调节反应体系对各种抑制物的耐受性。最终使pcr反应体系能够在足以扩增目的条带的模板浓度和破坏体系稳定的抑制物浓度之间获得平衡。除了dna中各类pcr抑制物的不利影响，大熊猫性别鉴定的pcr过程还容易受到环境中气溶胶污染影响。随着pcr轮次的增加，扩增产物容易因反复开盖、震荡、液体蒸发、反复吹吸液体等原因而溢出离心管外，导致下一轮pcr反应体系受到上几轮pcr产物的污染。这些环境气溶胶污染不易被消除，极易干扰大熊猫性别鉴定结果的准确性。但目前在大熊猫性别鉴定时普遍使用的pcr反应体系不能同时解决上述两个问题。因此，研制一种既能耐受dna中各类抑制物又能防止气溶胶污染的多重pcr预混液，对增加大熊猫性别鉴定结果准确性十分必要。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于解决大熊猫性别鉴定中pcr预混液对抑制物耐受性不足和防止环境气溶胶污染能力不足的技术问题，提供一种多重防污染pcr预混液及其在大熊猫性别鉴定中的应用，该pcr预混液中含有多种pcr辅剂和防污染组分，可以有效减轻模板dna中复杂抑制物对pcr反应体系平衡的破坏作用，消除扩增产物气溶胶污染对后续扩增的干扰，极大提高大熊猫乃至其它动物性别鉴定结果的准确性。
2、为达到以上技术目的，本申请采用的技术方案如下：
3、第一方面，本专利技术提供一种多重防污染pcr预混液，所述预混液按照终浓度组成包括：dna聚合酶，1-5 u；底物，100-700 nm；mgcl2，1-5 mm；牛血清白蛋白（bsa）， 0.02-1 mg/ml；表面活性剂，0.1%-1%v/v；抗氧化剂，0.1-3 mm；缓冲液，10-30 mm；一价阳离子组分，10-60 mm；金属离子螯合剂，0.1-4 mm；dna糖基化酶，0.5-3 u；稳定剂，0.01-3 m；扩增促进剂，4%-20% v/v；溶剂为水；其中，所述底物为dntp、datp、dttp、dgtp、dctp和dutp中的至少一种；所述一价阳离子组分为分别提供钾离子和铵根离子的化合物。
4、优选地，所述预混液按照终浓度组成包括：dna聚合酶，1-2.5 u；底物，500-700nm；mgcl2，1-2.5 mm；牛血清白蛋白（bsa）， 0.025-0.05 mg/ml；表面活性剂，0.3%-0.7%v/v；抗氧化剂，0.5-2 mm；缓冲液，10-20 mm；一价阳离子组分，20-50 mm；金属离子螯合剂，0.5-2 mm；dna糖基化酶，1-2 u；稳定剂，1.2-2.0 m；扩增促进剂，4%-10% v/v；溶剂为水。
5、优选地，所述dna聚合酶为taq聚合酶、pfu聚合酶、taq plus聚合酶、hotstart taq聚合酶、primerstar hs dna聚合酶和amplitaq gold dna聚合酶中的至少一种。
6、优选地，所述表面活性剂为吐温20、吐温21、吐温40、吐温60、吐温61、吐温80、司盘20、司盘40、司盘60、司盘80、司盘65、司盘85、tritonx100和np40中的至少一种，更优选为吐温20、tritonx100和np40中的至少一种。
7、优选地，所述抗氧化剂为二硫苏糖醇（dtt）和二硫赤藓糖醇（dte）中的至少一种。
8、优选地，所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（tris-hcl）、磷酸盐缓冲液（pbs）、3-吗啉丙磺酸（mops）和4-羟乙基哌嗪乙磺酸（hepes）中的至少一种。
9、优选地，所述一价阳离子组分中，提供钾离子的化合物选自氯化钾、硫酸钾、硝酸钾、醋酸钾中的一种，提供铵根离子的化合物选自硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、醋酸铵中的一种。。
10、优选地，所述金属离子螯合剂为乙二醇双四乙酸（egta）和乙二胺四乙酸（edta）中的至少一种。
11、优选地，所述dna糖基化酶为尿嘧啶dna糖基化酶或者热敏型尿嘧啶dna糖基化酶。尿嘧啶dna糖基化酶的简称为udg或者ung，热敏型尿嘧啶dna糖基化酶的简称为heat-labile udg或者heat-labile ung。
12、优选地，所述稳定剂为海藻糖和甜菜碱中的至少一种。
13、优选地，所述扩增促进剂为peg200-8000和dmso中的至少一种。
14、优选地，所述pcr预混液还包括ph调节剂，将所述pcr预混液ph调至7.5-8.5；更优选地，所述ph调节剂为氢氧化钠溶液。
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【技术保护点】
1.一种多重防污染PCR预混液，其特征在于，所述预混液按照终浓度组成包括：DNA聚合酶，1-5 U；底物，100-700 nM；MgCl2，1-5 mM；牛血清白蛋白（BSA）， 0.02-1 mg/mL；表面活性剂，0.1%-1%V/V；抗氧化剂，0.1-3 mM；缓冲液，10-30 mM；一价阳离子组分，10-60 mM；金属离子螯合剂，0.1-4 mM；DNA糖基化酶，0.5-3 U；稳定剂，0.01-3 M；扩增促进剂，4%-20%V/V；溶剂为水；其中，所述底物为dNTP、dATP、dTTP、dGTP、dCTP和dUTP中的至少一种；所述一价阳离子组分为分别提供钾离子和铵根离子的化合物。
2.根据权利要求1所述的PCR预混液，其特征在于，所述预混液按照终浓度组成包括：DNA聚合酶，1-2.5 U；底物，500-700 nM；MgCl2，1-2.5 mM；牛血清白蛋白（BSA）， 0.025-0.05 mg/mL；表面活性剂，0.3%-0.7%V/V；抗氧化剂，0.5-2 mM；缓冲液，10-20 mM；一价阳离子组分，20-50 mM；金属离子螯合剂，0.5
3.根据权利要求1或2所述的PCR预混液，其特征在于，所述DNA聚合酶为Taq聚合酶、Pfu聚合酶、Taq Plus聚合酶、HotStart Taq聚合酶、PrimerStar HS DNA聚合酶和AmpliTaqGold DNA聚合酶中的至少一种。
4.根据权利要求1~3任一项所述的PCR预混液，其特征在于，所述表面活性剂为吐温20、吐温21、吐温40、吐温60、吐温61、吐温80、司盘20、司盘40、司盘60、司盘80、司盘65、司盘85、TritonX100和NP40中的至少一种，优选为吐温20、TritonX100和NP40中的至少一种。
5.根据权利要求1~4任一项所述的PCR预混液，其特征在于，所述抗氧化剂为二硫苏糖醇（DTT）和二硫赤藓糖醇（DTE）中的至少一种。
6.根据权利要求1~5任一项所述的PCR预混液，其特征在于，所述缓冲液为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCL）、磷酸盐缓冲液（PBS）、3-吗啉丙磺酸（MOPS）和4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）中的至少一种。
7.根据权利要求1~6任一项所述的PCR预混液，其特征在于，所述一价阳离子组分中，提供钾离子的化合物选自氯化钾、硫酸钾、硝酸钾、醋酸钾中的一种，提供铵根离子的化合物选自硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、醋酸铵中的一种。
8.根据权利要求1~7任一项所述的PCR预混液，其特征在于，所述金属离子螯合剂为乙二醇双四乙酸（EGTA）和乙二胺四乙酸（EDTA）中的至少一种。
9.根据权利要求1~8任一项所述的PCR预混液，其特征在于，所述DNA糖基化酶为尿嘧啶DNA糖基化酶或者热敏型尿嘧啶DNA糖基化酶。
10.根据权利要求1~9任一项所述的PCR预混液，其特征在于，所述稳定剂为海藻糖和甜菜碱中的至少一种。
11.根据权利要求1~10任一项所述的PCR预混液，其特征在于，所述扩增促进剂为PEG200-8000和DMSO中的至少一种。
12.根据权利要求1~11任一项所述的PCR预混液，其特征在于，所述PCR预混液还包括pH调节剂，将所述PCR预混液pH调至7.5-8.5；优选地，所述pH调节剂为氢氧化钠溶液。
13.权利要求1-12任一项所述的PCR预混液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：按照所述PCR预混液的成分组成配料，并混合成溶液，即得。
14.权利要求1-12任一项所述的PCR预混液在制备PCR试剂盒上的应用。
15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述PCR试剂盒用于鉴定大熊猫性别；优选的，用于PCR的DNA样本来源为大熊猫的排泄物、血液、毛发、皮张、细胞以及组织。
16.一种用于鉴别大熊猫性别的PCR试剂盒，其特征在于，包括扩增引物和权利要求1-13任意一项所述的PCR预混液。
...【技术特征摘要】
1.一种多重防污染pcr预混液，其特征在于，所述预混液按照终浓度组成包括：dna聚合酶，1-5 u；底物，100-700 nm；mgcl2，1-5 mm；牛血清白蛋白（bsa）， 0.02-1 mg/ml；表面活性剂，0.1%-1%v/v；抗氧化剂，0.1-3 mm；缓冲液，10-30 mm；一价阳离子组分，10-60 mm；金属离子螯合剂，0.1-4 mm；dna糖基化酶，0.5-3 u；稳定剂，0.01-3 m；扩增促进剂，4%-20%v/v；溶剂为水；其中，所述底物为dntp、datp、dttp、dgtp、dctp和dutp中的至少一种；所述一价阳离子组分为分别提供钾离子和铵根离子的化合物。
2.根据权利要求1所述的pcr预混液，其特征在于，所述预混液按照终浓度组成包括：dna聚合酶，1-2.5 u；底物，500-700 nm；mgcl2，1-2.5 mm；牛血清白蛋白（bsa）， 0.025-0.05 mg/ml；表面活性剂，0.3%-0.7%v/v；抗氧化剂，0.5-2 mm；缓冲液，10-20 mm；一价阳离子组分，20-50 mm；金属离子螯合剂，0.5-2 mm；dna糖基化酶，1-2 u；稳定剂，1.2-2.0 m；扩增促进剂，4%-10% v/v；溶剂为水。
3.根据权利要求1或2所述的pcr预混液，其特征在于，所述dna聚合酶为taq聚合酶、pfu聚合酶、taq plus聚合酶、hotstart taq聚合酶、primerstar hs dna聚合酶和amplitaqgold dna聚合酶中的至少一种。
4.根据权利要求1~3任一项所述的pcr预混液，其特征在于，所述表面活性剂为吐温20、吐温21、吐温40、吐温60、吐温61、吐温80、司盘20、司盘40、司盘60、司盘80、司盘65、司盘85、tritonx100和np40中的至少一种，优选为吐温20、tritonx100和np40中的至少一种。
5.根据权利要求1~4任一项所述的pcr预混液，其特征在于，所述抗氧化剂为二硫苏糖醇（dtt）和...
【专利技术属性】
技术研发人员：寇洁，高洁，刘思琴，李嘉恒，庞惠中，刘佳文，张扬，
申请(专利权)人：成都大熊猫繁育研究基地，
类型：发明
国别省市：
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