【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物生物，具体涉及一种利用红椿叶片原生质体检测亚细胞定位的方法。
技术介绍
1、红椿是楝科香椿属的优质速生树种，材质优良且色泽艳丽，材用经济价值高，为我国国家ⅱ级重点保护野生植物。目前关于红椿遗传转化的研究主要集中于组织培养与稳定遗传体系。对于瞬时表达的研究鲜有报道。虽然构建的遗传转化体系较为稳定，但依旧存在周期长、转化效率不高、操作高要求等不可避免的缺陷，因此迫切需要一套高效、简便的红椿瞬时转化体系，扩充红椿遗传研究体系，加速红椿遗传改良及基因功能研究的发展。
2、红椿在幼林期，顶芽极易遭受麻楝蛀斑螟的取食危害，并蛀干导致干枝中空、断折，甚至死亡，严重影响红椿成材。目前对麻楝蛀斑螟的预防措施普遍采用的是化学防治法，而在物理防治法研究和应用相对较少。而化学防治仍在存在一定不足之处，该方法在红椿育种中无法大范围推广，会造成巨大的人力和物力消耗。因此，红椿的基因工程研究需要不断深入，来积极大力推进红椿的可持续发展。
3、前期研究中，发现当红椿自身散发的挥发性单萜化合物α-蒎烯与其他化合物(如壬醛、癸醛及α-松油醇等)存在一定比例关系的条件下，α-蒎烯的存在和含量对红椿而言，极有可能是吸引麻楝蛀斑螟的信号物质。在搭建了红椿全基因组测序平台的基础上，通过红椿3月龄(不危害阶段)和2年生(严重危害阶段)叶片的转录组分析，筛选到一批萜类化合物合成途径差异表达基因，其中差异最显著就包括重要的限速酶1-脱氧-d-木酮糖-5-磷酸合酶(1-deoxy-d-xylulose-5-phosphate syntha
技术实现思路
1、针对现有技术中的上述不足，本专利技术提供一种利用红椿叶片原生质体检测亚细胞定位的方法。
2、本专利技术的目的是提供一种利用红椿叶片原生质体检测亚细胞定位的方法，包括如下步骤：
3、s1.选取红椿2月龄的无菌种子苗的幼嫩叶片，垂直于主叶脉将叶片切成细条状叶，浸没在0.6m甘露醇溶液中20min，取出细条状叶吸干水分后再放入酶解液中浸透，50rpm、黑暗条件下酶解4h；
4、s2.往步骤s1的酶解液中放入等体积的w5溶液，通过200目细胞筛过滤至离心管中离心，吸除上清，再加入5ml w5溶液，再次离心；离心结束后，再加入适量的w5溶液重悬至原生质体均匀分布，并置于冰上静置30min，使原生质体沉于离心管管底，吸除上清，加入mmg溶液并重悬，获得原生质体悬混液；
5、s3.将含有待检测亚细胞定位基因的质粒与原生质体悬混液混合均匀后，于室温静置10min；再加入peg-ca2+溶液，混合均匀后，室温黑暗条件孵育30min；孵育结束后，加入w5溶液终止反应，混匀后于离心，吸除上清；再次加入w5溶液，混匀后于离心，吸除上清；最后加入500μl w5溶液，混匀后于25℃黑暗培养48h；黑暗培养结束后，在离心富集原生质体沉淀，并仅保留适量的上清液混匀原生质体沉淀，得到转入待检测亚细胞定位基因的原生质体溶液；
6、s4.取适量的转入待检测亚细胞定位基因的原生质体溶液，用于观察亚细胞定位情况。
7、优选，所述的步骤s1中的酶解液，每10ml体系的酶解液配制方法如下：先混合1.5％vol纤维素酶、1.5％vol离析酶、0.6m甘露醇、ph5.7的20mm mes、50mm kcl、7.5mlddh2o；55℃处理10min；冷却至室温后，再加入10mm cacl2和0.1wt％的bsa，用ddh2o定容至10ml，然后用0.45μm滤膜过滤灭菌。
8、优选，所述的步骤s2中，w5溶液的组成为：ph为5.7的2mm mes、154mm nacl、125mmcacl2、5mm kcl，溶剂为水；mmg溶液的组成为：ph为5.7的4mm mes、0.6m甘露醇、15mm mgcl2，溶剂为水。
9、优选，所述的步骤s2中的离心为在940rpm、4℃的条件中离心2min。
10、优选，所述的步骤s2中所获得的原生质体悬混液的密度为2×105个/ml。
11、优选，所述的步骤s3为将20ng含有待检测亚细胞定位基因的质粒与100μl原生质体悬混液混合均匀后，于室温静置10min；再加入110μl peg-ca2+溶液，混合均匀后，室温黑暗条件孵育30min；
12、优选，所述的步骤s3中的含有待检测亚细胞定位基因的质粒为pcambia1300-35s-tcdxs1-gfp或pcambia1300-35s-tcdxs5-gfp；所述的tcdxs1的核苷酸序列如seq id no.1所示，tcdxs5的核苷酸序列如seq id no.2所示。
13、优选，所述的步骤s3中的peg-ca2+溶液，其组成为：40wt％peg4000、0.6m甘露醇、100mm cacl2，溶剂为水。
14、优选，所述的步骤s3中的离心为500rpm条件离心5min。
15、本专利技术的有益效果：
16、(1)用于亚细胞定位的红椿原生质体瞬时转化方法也可用于基因功能的验证、蛋白质互作分析以及基因组编辑的方面，为红椿育种与遗传体系的完善提供高效简便的技术支持。
17、(2)本专利技术建立的亚细胞定位方法采取的是原生质体瞬时表达的方法，可快速应用于红椿各类基因表达产物的亚细胞定位，为红椿基因功能研究提供了便捷的技术。
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1.一种利用红椿叶片原生质体检测亚细胞定位的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤S1中的酶解液，每10mL体系的酶解液配制方法如下：先混合1.5％vol纤维素酶、1.5％vol离析酶、0.6M甘露醇、pH5.7的20mM MES、50mM KCl、7.5mL ddH2O；55℃处理10min；冷却至室温后，再加入10mM CaCl2和0.1wt％的BSA，用ddH2O定容至10mL，然后用0.45μm滤膜过滤灭菌。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤S2中，W5溶液的组成为：pH为5.7的2mM MES、154mM NaCl、125mM CaCl2、5mM KCl，溶剂为水；
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤S2中的离心为在940rpm、4℃的条件中离心2min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤S2中所获得的原生质体悬混液的密度为2×105个/mL。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤S3为将2
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤S3中的含有待检测亚细胞定位基因的质粒为pCAMBIA1300-35s-TcDXS1-GFP或pCAMBIA1300-35s-TcDXS5-GFP；所述的TcDXS1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，TcDXS5的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤S3中的PEG-Ca2+，其组成为：40wt％PEG4000、0.6M甘露醇、100mM CaCl2，溶剂为水。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤S3中的离心为500rpm条件离心5min。
...【技术特征摘要】
1.一种利用红椿叶片原生质体检测亚细胞定位的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤s1中的酶解液，每10ml体系的酶解液配制方法如下：先混合1.5％vol纤维素酶、1.5％vol离析酶、0.6m甘露醇、ph5.7的20mm mes、50mm kcl、7.5ml ddh2o；55℃处理10min；冷却至室温后，再加入10mm cacl2和0.1wt％的bsa，用ddh2o定容至10ml，然后用0.45μm滤膜过滤灭菌。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤s2中，w5溶液的组成为：ph为5.7的2mm mes、154mm nacl、125mm cacl2、5mm kcl，溶剂为水；
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤s2中的离心为在940rpm、4℃的条件中离心2min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤s2中所获得的原生质体悬混液的...
【专利技术属性】
技术研发人员：柯嘉豪，李培，叶春意，缪雨杰，庄诺，王鑫林，田梓熠，李悦，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：
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