【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种鉴别中华大蟾蜍不同药用部位的差异性特征多肽库及其应用。
技术介绍
1、中华大蟾蜍（ bufo gargarizans）是一种中医临床常用的药用源动物，蟾蜍“味辛、性凉,有毒。归心、肝、脾、肺经”,能“解毒散结,消积利水,杀虫消疳。主治疽,疔疮,发背,瘰疬,恶疮癥疲癖积,胀,水肿,小儿疳积,破伤风,慢性咳喘”,古今验方将其广泛应用于拔毒消肿、定痛杀虫、强心利尿。现代临床又将其用于抗肿瘤、镇痛、利水消肿、增强机体免疫力等。蟾蜍全身均可人药,常用的有蟾酥、蟾皮等。
2、近年来，由于蟾酥临床应用不断扩大，价格昂贵，商品蟾酥品种混杂、掺杂、掺假现象普遍存在。传统的如性状鉴别、显微鉴别和理化鉴别，无法有效的区分蟾酥和蟾皮、蟾肉、蟾骨，具有局限性。
技术实现思路
1、针对现有技术中存在的问题，本专利技术提供了一种鉴别中华大蟾蜍不同药用部位的差异性特征多肽库。
2、本专利技术还提供了上述差异性特征多肽库在区分鉴别蟾酥和蟾皮、蟾肉、蟾骨中的应用。
3、本专利技术为了实现上述目的所采用的技术方案为：
4、本专利技术提供了一种鉴别中华大蟾蜍不同药用部位的差异性特征多肽库，所述特征多肽库由序列如seq id no.1-29组成。
5、本专利技术还提供了上述差异性特征多肽库在快速区分鉴别中华大蟾蜍不同药用部位中的应用，包括以下步骤：
6、（1）样品制备：精
7、（2）还原烷基化：取蛋白样品溶液，加入二硫苏糖醇（dtt）溶液，室温放置一段时间；再加入碘乙酰胺（iaa）溶液，室温黑暗处放置一段时间；然后加入碳酸氢铵溶液，得还原烷基化蛋白溶液；
8、（3）蛋白酶切和脱盐：将还原烷基化蛋白溶液中加入胰蛋白酶，过夜酶切；然后加入fa终止酶切反应，进行脱盐。
9、（4）采用三重四极杆液相色谱质谱法进行鉴定。
10、进一步的，步骤（1）中，所述样品粉末和蛋白裂解液的比例为25mg：1ml；所述蛋白裂解液的组成为：尿素21.0 g，硫脲7.60 g，triton x-100 50 μl，加入50 mm碳酸氢铵溶液定容至50 ml。
11、进一步的，步骤（1）中，所述超声提取的时间为30min；所述离心为4℃温度下，13000r∙min-1离心15min。
12、进一步的，步骤（2）中，所述二硫苏糖醇（dtt）在蛋白样品溶液中的浓度为10 mm；所述二硫苏糖醇（dtt）溶液的浓度为1m；所述碘乙酰胺（iaa）在蛋白样品溶液中的浓度为50mm；所述碘乙酰胺（iaa）溶液的浓度为1m；所述碳酸氢铵溶液的加入量为使蛋白样品溶液中尿素浓度降低至1 m以下；所述碳酸氢铵溶液的浓度为50 mm。
13、进一步的，步骤（2）中，所述室温放置的时间为3h；所述室温黑暗处放置的时间为1h。
14、进一步的，步骤（3）中，所述还原烷基化蛋白溶液中，蛋白量和胰蛋白酶的质量比为100:1；所述fa在还原烷基化蛋白溶液中的质量浓度为0.5%。
15、进一步的，步骤（3）中，所述酶切为37 ℃温度下，过夜酶切；所述脱盐采用sep-pakc18柱。
16、进一步的，步骤（4）中，所述液相色谱的条件为：以thermo acclaim pepmap c18柱（100 μm×3.5 cm, 5 μm）脱盐富集，在thermo acclaim pepmap c18柱（75 μm×15 cm, 3 μm）上分离，流动相：0.1%（v/v）的甲酸水溶液（a）和0.1%（v/v）的甲酸乙腈溶液（b），梯度洗脱，流速：300 nl·min-1，进样量：1 µl；所述梯度洗脱的程序为：0~1 min，99%→94%a；1~96min，94%→78%a；96~113 min，78%→70%a；113~117 min，70%→5%a；117~120 min，5%a。
17、进一步的，所述质谱的条件为：在正离子模式下分析，喷雾电压：2.1 kv，离子传输毛细管温度：275 ℃，s-lens传输效率：60%；一级质谱使用orbitrap作为质量分析器，分辨率为60000，采集范围为350-1550（ m/z）；二级质谱同样使用orbitrap作为质量分析器，扫描模式：data-dependent msn scan模式，碎裂模式：hcd模式。
18、现有技术中，蟾酥和蟾皮、蟾肉、蟾骨在蛋白成分上存在差异，但是蛋白大分子的检测比较繁琐，不利于方法向标准转化。本专利技术利用多肽作为指标成分对蟾酥与干蟾药材进行鉴别分析，专属性强，稳定性好，不受加工过程干扰，可多种药材同时鉴定，优势明显。
19、本专利技术的有益效果为：
20、（1）本专利技术提供的鉴别方法，能够同时对蟾酥、蟾皮、蟾肉、蟾骨进行鉴别鉴定，专属性好且高效；
21、（2）本专利技术提供的特征多肽库，专属性强，后续进行应用过程中，检测方法简单快捷，建立蟾酥的定量测定方法和对蟾酥中干蟾成分的检查方法，为蟾酥的质量控制提供了方法支持，同时提高了检测的准确性。
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1.一种鉴别中华大蟾蜍不同药用部位的差异性特征多肽库，其特征在于，所述特征多肽库由序列如SEQ ID NO.1-29组成；具体为
2.一种如权利要求1所述的差异性特征多肽库在快速区分鉴别中华大蟾蜍不同药用部位中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（1）中，所述样品粉末和蛋白裂解液的比例为25mg：1mL；所述蛋白裂解液的组成为：尿素21.0 g，硫脲7.60 g，Triton X-100 50 μL，加入50 mM碳酸氢铵溶液定容至50 mL。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，步骤（1）中，所述超声提取的时间为30min；所述离心为4℃温度下，13000r∙min-1离心15min。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（2）中，所述二硫苏糖醇（DTT）在蛋白样品溶液中的浓度为10 mM；所述二硫苏糖醇（DTT）溶液的浓度为1M；所述碘乙酰胺（IAA）在蛋白样品溶液中的浓度为50 mM；所述碘乙酰胺（IAA）溶液的浓度为1M；所述碳酸氢铵溶液的加入量为使蛋白样品溶
6.根据权利要求2或5所述的应用，其特征在于，步骤（2）中，所述室温放置的时间为3h；所述室温黑暗处放置的时间为1h。
7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（3）中，所述还原烷基化蛋白溶液中，蛋白量和胰蛋白酶的质量比为100:1；所述FA在还原烷基化蛋白溶液中的质量浓度为0.5%。
8.根据权利要求2或5所述的应用，其特征在于，步骤（3）中，所述酶切为37 ℃温度下，过夜酶切；所述脱盐采用Sep-Pak C18柱。
9.根据权利要求2-8任一项所述的应用，其特征在于，步骤（4）中，所述液相色谱的条件为：以Thermo Acclaim PepMap C18柱（100 μm×3.5 cm, 5 μm）脱盐富集，在ThermoAcclaim PepMap C18柱（75 μm×15 cm, 3 μm）上分离，流动相：0.1%（v/v）的甲酸水溶液（A）和0.1%（v/v）的甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脱，流速：300 nL·min-1，进样量：1 µL；所述梯度洗脱的程序为：0~1 min，99%→94%A；1~96 min，94%→78%A；96~113 min，78%→70%A；113~117 min，70%→5%A；117~120 min，5%A。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述质谱的条件为：在正离子模式下分析，喷雾电压：2.1 kV，离子传输毛细管温度：275 ℃，S-Lens传输效率：60%；一级质谱使用Orbitrap作为质量分析器，分辨率为60000，采集范围为350-1550（m/z）；二级质谱同样使用Orbitrap作为质量分析器，扫描模式：Data-Dependent MSn Scan模式，碎裂模式：HCD模式。
...【技术特征摘要】
1.一种鉴别中华大蟾蜍不同药用部位的差异性特征多肽库，其特征在于，所述特征多肽库由序列如seq id no.1-29组成；具体为
2.一种如权利要求1所述的差异性特征多肽库在快速区分鉴别中华大蟾蜍不同药用部位中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（1）中，所述样品粉末和蛋白裂解液的比例为25mg：1ml；所述蛋白裂解液的组成为：尿素21.0 g，硫脲7.60 g，triton x-100 50 μl，加入50 mm碳酸氢铵溶液定容至50 ml。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，步骤（1）中，所述超声提取的时间为30min；所述离心为4℃温度下，13000r∙min-1离心15min。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（2）中，所述二硫苏糖醇（dtt）在蛋白样品溶液中的浓度为10 mm；所述二硫苏糖醇（dtt）溶液的浓度为1m；所述碘乙酰胺（iaa）在蛋白样品溶液中的浓度为50 mm；所述碘乙酰胺（iaa）溶液的浓度为1m；所述碳酸氢铵溶液的加入量为使蛋白样品溶液中尿素浓度降低至1 m以下；所述碳酸氢铵溶液的浓度为50mm。
6.根据权利要求2或5所述的应用，其特征在于，步骤（2）中，所述室温放置的时间为3h；所述室温黑暗处放置的时间为1h。
7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（3）中，所述还原烷基化蛋白溶液中，蛋白量和胰蛋...
【专利技术属性】
技术研发人员：林永强，焦阳，陈娟，薛菲，尹雪，牛艳，于雅萌，于凤蕊，周倩倩，马双成，
申请(专利权)人：山东省食品药品检验研究院，
类型：发明
国别省市：
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