【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物学和医学领域，更具体地涉及一种基于滋养层细胞置换的重构囊胚的制备与应用。
技术介绍
1、体细胞核转移(scnt)技术已广泛应用于克隆哺乳动物物种，包括绵羊(wilmut etal.,1997)、牛(kato et al.,1998)、老鼠(wakayama et al.，1998)、猪(polejaeva etal.,2000)、山羊(baguisi et al.,1999)、兔子(chesnéet al.,2002)和狗(lee et al.,2005)。最近，通过优化体细胞核转移协议和应用表观遗传调控因子(包括组蛋白去甲基化酶kdm4d和组蛋白去乙酰化抑制剂trichostatin a(tsa))，利用scnt克隆了野生型和基因编辑的食蟹猴(macaca fascicularis)，活产率分别为1.5％和2.5％(liu等人，2019b；liuet al.,2018)。然而，这种克隆效率远远低于本专利技术人之前报道的正常受精卵非人灵长类(nhp)胚胎(27.6％)(sun et al.,2008)。
2、传统上，几乎所有克隆的哺乳动物物种都表现出极低的出生率，大多数物种的出生率为1-3％，牛的出生率为5-20％(rodriguez-osorio et al.,2012；yang等人，2007)。与如此低的存活率相一致的是，体细胞克隆动物的胚胎发育异常，尤其是在胚胎外谱系中被报道(yang et al.,2007)。仔猪scnt胎盘的绒毛密度和绒毛外细胞滋养层厚度远低于人工授精胎盘(ao et a
3、另一方面，胚胎缺陷在克隆动物中也很常见。在scnt衍生的牛和小鼠中观察到出生体重超标或大龄后代综合征(c.l.keefer等人，1994；j.m.wilson等人，1995；s.m.willadsen等人，1991；wakayama等人，2006；yang等人，2007)。其他症状，如出生体重低、呼吸系统功能障碍和异常的器官发育也是scnt胎儿的常见异常(ao等，2017；yang等人，2007)。有趣的是，当结合四倍体互补时，通过小鼠scnt胚胎干细胞获得的的活产率远高于单独的scnt胚胎(20～30％vs.1～2％)，这表明克隆胚胎的滋养外胚层缺陷是胚胎发育失败的主要原因(wakayama et al.,2006；yang等人，2007)。
4、之前的研究证明了内细胞团(icm)或滋养层交换(te)技术获得活产的可行性(loiet al.,2018)，尽管这种方法未能提高牛的克隆效率(murakami et al.,2006)。
5、综上，本领域目前急需能显著提升克隆胚胎发育成功率的方法与产品。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种基于滋养层细胞置换的重构囊胚的制备与应用。
2、本专利技术第一方面提供一种囊胚期胚胎滋养层细胞的制备方法，包括以下步骤：
3、(a)提供第一胚胎，所述第一胚胎为处于囊胚期的非人灵长类动物胚胎，对所述第一胚胎的透明带激光打孔，打孔的位置为所述第一胚胎的内细胞团(inner cell mass,icm)所在位置，从而获得经激光打孔处理的第一胚胎；
4、(b)培养所述第一胚胎，其内细胞团会由所述激光打孔位置自行排出，从而获得腔内不含内细胞团的第一胚胎空囊胚；
5、(c)提供分离自第二胚胎的内细胞团，所述第二胚胎为处于囊胚期的非人灵长类动物胚胎，将所述分离自第二胚胎的内细胞团导入步骤(b)所获得的腔内不含内细胞团的第一胚胎空囊胚中；其中，在所述导入步骤之前、之中、或之后，将所述第一胚胎的内细胞团从所述空囊胚上分离、移除；从而获得重构的囊胚；
6、在另一优选例中，所述所有步骤的所有显微操作均在带有加热台的显微操作系统中进行。
7、在另一优选例中，所述胚胎为非人灵长动物的胚胎。
8、在另一优选例中，所述胚胎为存活状态的胚胎。
9、在另一优选例中，在步骤(a)中，所述第一胚胎处于囊胚中晚期。
10、在另一优选例中，在步骤(a)中，所述第二胚胎处于囊胚中晚期。
11、在另一优选例中，在步骤(b)中，所获得的腔内不含内细胞团的第一胚胎空囊胚，可以为带有外排的所述第一胚胎的内细胞团，也可以为外排的所述第一胚胎的内细胞团已被分离、移除。
12、在另一优选例中，所述方法还包括，将所述重构的囊胚再生成非人哺乳动物。
13、在另一优选例中，所述胚胎为通过向成熟卵母细胞进行单精子胞浆注射获得的胚胎。
14、在另一优选例中，所述胚胎为通过向卵母细胞进行核移植获得的克隆的胚胎。
15、在另一优选例中，步骤(a)中所述激光的参数为power：100％，pulse：100～200μs，并且可在打孔位置多次打孔以确保所述透明带的破裂。
16、在另一优选例中，步骤(b)中所述继续培养的时间为4至8小时，更佳地，5至7小时，最佳地，6小时。
17、在另一优选例中，步骤(c)中分离、获得所述第二胚胎的内细胞团，发生在步骤(b)中所述的激光打孔后的4至5小时、步骤(c)中所述的滋养层细胞置换前的1至2小时。
18、在另一优选例中，步骤(c)中分离、获得所述第二胚胎的内细胞团的，是通过常规的免疫外科法实现的。
19、在另一优选例中，所述免疫外科法包括抗体孵育0.5小时，补体孵育0.5小时，共计约1小时。
20、在另一优选例中，步骤(c)还包括：在分离获得所述第二胚胎的内细胞团后，使用新鲜的培养基清洗所述内细胞团。
21、在另一优选例中，步骤(c)所述的将所述第二胚胎的内细胞团注射入步骤(b)所获得的腔内不含内细胞团的第一胚胎空囊胚中，包括步骤：
22、(c1)将所述第二胚胎的内细胞团与步骤(b)所获得的腔内不含内细胞团的第一胚胎空囊胚共同放在显微操作台上；
23、(c2)在视野下，左侧用直径约为120μm的持卵针将步骤(b)所获得的腔内不含内细胞团的第一胚胎空囊胚固定在视野下，调整其方向，尽可能避免使孵育出来的、仍粘连在步骤(b)所获得的腔内不含内细胞团的第一胚胎空囊胚的外侧的所述第一胚胎的内细胞团朝向视野的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种囊胚期胚胎滋养层细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述所有步骤的所有显微操作均在带有加热台的显微操作系统中进行。
3.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述胚胎为非人灵长动物的胚胎。
4.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述胚胎为存活状态的胚胎。
5.如权利要求1所述方法，其特征在于，在步骤(a)中，所述第一胚胎处于囊胚中晚期。
6.如权利要求1所述方法，其特征在于，在步骤(a)中，所述第二胚胎处于囊胚中晚期。
7.如权利要求1所述方法，其特征在于，在步骤(b)中，所获得的腔内不含内细胞团的第一胚胎空囊胚，可以为带有外排的所述第一胚胎的内细胞团，也可以为外排的所述第一胚胎的内细胞团已被分离、移除。
8.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述方法还包括，将所述重构的囊胚再生成非人哺乳动物。
9.一种重构的囊胚，其特征在于，所述重构的囊胚是以如权利要求1所述的方法制备的。
10.如权利要求2所述重构的囊胚，其特征在于，所
...【技术特征摘要】
1.一种囊胚期胚胎滋养层细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述所有步骤的所有显微操作均在带有加热台的显微操作系统中进行。
3.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述胚胎为非人灵长动物的胚胎。
4.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述胚胎为存活状态的胚胎。
5.如权利要求1所述方法，其特征在于，在步骤(a)中，所述第一胚胎处于囊胚中晚期。
6.如权利要求1所述方法，其特征在于，在步骤(a)中，所述第二胚胎处于囊胚中晚期...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙强，廖兆蒂，刘真，
申请(专利权)人：中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心，
类型：发明
国别省市：
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