【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因编辑领域，具体而言，涉及一种cas蛋白、其组合物及应用。
技术介绍
1、clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats(crispr)系统,是细菌和古细菌为了防御入侵噬菌体的dna而形成的。crispr系统的免疫干扰过程主要包括3个阶段：适应、表达和干扰。适应阶段，crispr系统会将来自噬菌体或质粒的dna短片段整合到前导序列和第一段重复序列之间，每一次整合都伴随着重复序列的复制，进而形成一个新的重复-间隔序列单元。表达阶段，crispr基因座会被转录成一段crispr rna(crrna)前体(pre-crrna)，该前体在cas蛋白和tracrrna的存在下会在重复序列处被进一步加工成小的crrna。成熟的crrna与cas蛋白形成cas/crrna复合体。干扰阶段，crrna通过其与靶序列互补的区域引导cas/crrna复合体寻找靶点，并在靶点位置通过cas蛋白的核酸酶活性造成靶点位置的双链dna断裂，从而使靶标dna失去原有功能。crispr系统分为i，ii，ii i型三个家族，其中ii型系统最常见的为crispr/cas9系统，cas9蛋白可在反式编码小rna(trans-encoded smallrna，tracrrna)的协助下将pre-crrna加工成与tracrrna结合的成熟crrna。之后，人们发现通过人工构建模拟crrna：tracrrna复合体的单链嵌合体引导rna(guiderna)，即可有效的介导cas9蛋白对靶点的识别和
技术实现思路
1、本专利技术的主要目的在于提供一种新的cas蛋白、其组合物及应用，以满足上述应用需求。基于此，本专利技术还提供了新的crispr-cas组合物以及基于该系统的基因编辑方法和核酸检测方法。
2、在一个方面，本专利技术提供了一种cas蛋白，其包含与seq id nos.1-6中任一条氨基酸序列具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％同一性的氨基酸序列，并且基本保留了其源自的序列的生物学功能；
3、在一个实施方案中，所述cas蛋白的氨基酸序列与seq id nos.1-6任意一条氨基酸序列相比，具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，并且基本保留了其源自的序列的生物学功能；
4、在一个实施方案中，所述的cas蛋白，其包含seq id nos.1-6任一项所示的氨基酸序列；
5、或与seq id nos：1-6任一项所示的序列相比，具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸的置换、缺失或添加)的序列；或与seq id nos.1-6任一项所示的氨基酸序列具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的氨基酸序列同一性的序列；
6、在一个实施方案中，所述蛋白具有seq id nos.1-6任一项所示的氨基酸序列。
7、本领域技术人员清楚，可以改变蛋白质的结构而不对其活性和功能性产生不利影响，例如在蛋白质氨基酸序列中引入一个或多个保守性氨基酸取代，而不会对蛋白质分子的活性和/或三维结构产生不利影响。
8、本领域技术人员清楚保守性氨基酸取代的实例以及实施方案。具体的说，可以用与待取代位点属于相同组的另一氨基酸残基取代该氨基酸残基，即用非极性氨基酸残基取代另一非极性氨基酸残基，用极性不带电荷的氨基酸残基取代另一极性不带电荷的氨基酸残基，用碱性氨基酸残基取代另一碱性氨基酸残基，和用酸性氨基酸残基取代另一酸性氨基酸残基。这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的。只要取代不导致蛋白质生物活性的失活，则一种氨基酸被属于同组的其他氨基酸替换的保守取代落在本专利技术的范围内。因此，本专利技术的蛋白可以在氨基酸序列中包含一个或多个保守性取代,这些保守性取代最好根据表1进行替换而产生。另外，本专利技术也涵盖还包含一个或多个其他非保守取代的蛋白，只要该非保守取代不显著影响本专利技术的蛋白质的所需功能和生物活性即可。
9、保守氨基酸置换可以在一个或多个预测的非必需氨基酸残基处进行。“非必需”氨基酸残基是可以发生改变(缺失、取代或置换)而不改变生物活性的氨基酸残基，而“必需”氨基酸残基是生物活性所需的。“保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替代的置换。氨基酸置换可以在cas酶的非保守区域中进行。一般而言，此类置换不对保守的氨基酸残基，或者不对位于保守基序内的氨基酸残基进行，其中此类残基是蛋白质活性所需的。然而，本领域技术人员应当理解，功能变体可以具有较少的在保守区域中的保守或非保守改变。
10、在某些实施方案中，被认为是相互保守性置换的氨基酸的所选组：
11、
12、本领域技术人员已经知晓，从蛋白质的n和/或c末端改变(置换、删除、截短或插入)一或多个氨基酸残基而仍可以保留其功能活性。因此，从本专利技术的cas蛋白的n和/或c末端改变了一或多个氨基酸残基、同时保留了其所需功能活性的蛋白，也在本专利技术的范围内。这些改变可以包括通过现代分子方法例如pcr而引入的改变，所述方法包括借助于在pcr扩增中使用的寡核苷酸之中包含氨基酸编码序列而改变或延长蛋白质编码序列的pcr扩增。
13、应认识到，蛋白质可以以各种方式进行改变，包括氨基酸置换、删除、截短和插入，用于此类操作的方法是本领域技术人员通常已知晓的。
14、例如，可以通过对dna的突变来制备cas蛋白的氨基酸序列变体。还可以通过其他诱变形式和/或通过定向进化来完成，例如，使用已知的诱变、重组和/或改组方法，结合相关的筛选方法，来进行一或多个氨基酸取代；或一至多个氨基酸的缺失和/一至多个氨基酸插入。
15、本领域技术人员能够理解，本专利技术cas蛋白中的这些微小氨基酸变化可以出现(例如，天然存在的突变)或者产生(例如，可使用r-dna技术)而不损失蛋白质功能或活性。如果这些突变出现在蛋白的催化结构域、活性位点或其它功能结构域中，则多肽的性质可改变，但多肽可保持其活性。如果存在的突变不接近催化结构域、活性位点或其它功能结构域中本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种Cas蛋白，其特征在于，所述蛋白选自下组：
2.一种融合蛋白，所述融合蛋白包括权利要求1所述的Cas蛋白和一个或多个功能结构域。
3.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸为编码权利要求1所述的Cas蛋白或权利要求2中所述融合蛋白的核苷酸序列，或编码权利要求1所述Cas蛋白或权利要求2所述融合蛋白。
4.一种CRISPR-Cas组合物，所述组合物包含：
5.根据权利要求4所述的CRISPR-Cas组合物，其包括一个或多个载体，所述一个或多个载体包含：
6.一种递送系统，其特征在于，所述递送系统包括权利要求1所述的Cas蛋白，或权利要求2所述的融合蛋白，或权利要求3所述的多核苷酸，或权利要求4-5任一项所述的CRISPR-Cas组合物。
7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求1所述的Cas蛋白，或权利要求2所述的融合蛋白，或权利要求3所述的多核苷酸，或权利要求4-5中任一项所述的CRISPR-Cas组合物，或权利要求6所述的递送系统。
8.一种靶向和编辑靶核酸或切割靶核酸的方
9.一种在识别靶核酸后非特异性降解或切割单链核酸的方法，其特征在于，所述方法包括使所述靶核酸的靶序列与权利要求4-5任一项所述的CRISPR-Cas组合物接触。
10.一种靶向和切割双链靶核酸的方法，其特征在于，所述方法包括使所述双链靶核酸与权利要求4-5任一项CRISPR-Cas组合物接触。
11.一种诱导细胞状态改变的方法，其特征在于，所述方法包括使权利要求4-5中任一项所述的CRISPR-Cas组合物与细胞中的所述靶核酸接触。
12.一种试剂盒，包括权利要求1所述的Cas蛋白、权利要求2所述的融合蛋白或权利要求3中的多核苷酸，或权利要求4-5任一项所述的CRISPR-Cas组合物，或权利要求6所述宿主细胞，所述试剂盒的组分在相同或不同的容器中。
13.根据权利要求12所述的试剂盒，所述试剂盒用于基因或基因组编辑、疾病治疗、靶向靶基因、切割目的基因或非目的基因的一种或多种。
14.一种检测样品中靶核酸的方法，所述方法包括将样品与权利要求4-5任一项所述的CRISPR-Cas组合物和非靶序列接触；检测非靶序列被切割产生的可检测信号，从而检测靶核酸；所述非靶序列不与所述向导RNA杂交。
15.权利要求1所述的Cas蛋白，或权利要求2所述的融合蛋白，或权利要求3所述的多核苷酸，或权利要求4-5任一项所述的CRISPR-Cas组合物，或权利要求6所述的递送系统，或权利要求7所述的宿主细胞，或所述权利要求8-10在核酸检测中的应用。
16.权利要求1所述的Cas蛋白，或权利要求2所述的融合蛋白，或权利要求3所述的多核苷酸，或权利要求4-5任一项所述的CRISPR-Cas组合物，或权利要求6所述的递送系统，或权利要求7所述的宿主细胞在制备用于治疗有需要的受试者的病症或疾病的药物中的应用。
17.根据权利要求16所述的应用，所述病症或疾病包括囊性纤维化、进行性假肥大性肌营养不良、贝克肌营养不良、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、庞贝病、强直性肌营养不良、亨廷顿病、脆性X综合征、弗里德赖希共济失调、肌萎缩侧索硬化、额颞叶痴呆、遗传性慢性肾脏病、高脂血症、高胆固醇血症、莱伯氏先天性黑蒙、镰状细胞病、高胆固醇血症、转甲状腺素蛋白淀粉样变或β-地中海贫血中的一种或多种。
...【技术特征摘要】
1.一种cas蛋白，其特征在于，所述蛋白选自下组：
2.一种融合蛋白，所述融合蛋白包括权利要求1所述的cas蛋白和一个或多个功能结构域。
3.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸为编码权利要求1所述的cas蛋白或权利要求2中所述融合蛋白的核苷酸序列，或编码权利要求1所述cas蛋白或权利要求2所述融合蛋白。
4.一种crispr-cas组合物，所述组合物包含：
5.根据权利要求4所述的crispr-cas组合物，其包括一个或多个载体，所述一个或多个载体包含：
6.一种递送系统，其特征在于，所述递送系统包括权利要求1所述的cas蛋白，或权利要求2所述的融合蛋白，或权利要求3所述的多核苷酸，或权利要求4-5任一项所述的crispr-cas组合物。
7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求1所述的cas蛋白，或权利要求2所述的融合蛋白，或权利要求3所述的多核苷酸，或权利要求4-5中任一项所述的crispr-cas组合物，或权利要求6所述的递送系统。
8.一种靶向和编辑靶核酸或切割靶核酸的方法，其特征在于，所述方法包括使所述靶核酸与权利要求1所述的cas蛋白，或权利要求2所述的融合蛋白，或权利要求3中的多核苷酸，或权利要求4-5任一项所述的crispr-cas组合物，或权利要求6所述宿主细胞接触。
9.一种在识别靶核酸后非特异性降解或切割单链核酸的方法，其特征在于，所述方法包括使所述靶核酸的靶序列与权利要求4-5任一项所述的crispr-cas组合物接触。
10.一种靶向和切割双链靶核酸的方法，其特征在于，所述方法包括使所述双链靶核酸与权利要求4-5任一项crispr-cas组合物接触。
11.一种诱导细胞状态改变的方法，其特征在于，所述方法包...
【专利技术属性】
技术研发人员：张红玲，郑燕秋，
申请(专利权)人：尧唐南京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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