【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及纳米生物材料，具体涉及一种功能化修饰的人轻链铁蛋白及其应用。
技术介绍
1、人轻链铁蛋白 (human light chain ferritin，简称lfn) 是由24个蛋白亚基自组装形成的空心笼状蛋白质，外径12 nm，内径8 nm。由于其具有良好的水溶性、热稳定性和生物相容性等稳定的理化性质，因此被广泛应用于纳米药物递送与疾病治疗，成为一个极具潜力的纳米蛋白质药物平台。
2、原核表达系统是目前研究最为成熟的表达系统，在外源蛋白表达领域得到广泛的应用。然而功能化修饰后铁蛋白在原核表达过程中一直存在着铁蛋白纳米颗粒基因修饰后不稳定的问题，极易形成包涵体。常规的纯化方法是通过高浓度尿素对包涵体进行变性复性，随后再进一步纯化复性后的蛋白，该方法蛋白产率较低，且极易对铁蛋白这种具有特殊空间结构的蛋白形成不可逆的结构破坏。
3、因此，亟需设计和开发一种功能化修饰的铁蛋白促溶表达改造及纯化方法，能够通过对修饰后铁蛋白的分子水平上优化，继而使其在蛋白表达过程中形成上清表达，清除包涵体带来的纯化过程中的蛋白损失，有效提高蛋白回收率，降低生产成本。该方法有效解决了功能化铁蛋白表达过程中的不稳定等问题，使其在功能修饰的重组蛋白药物和纳米药物递送实现更广泛的应用，在探究其他重组蛋白原核表达过程中同样具有重要参考意义。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种功能化修饰的人轻链铁蛋白及其应用，不仅具有安全、高效的特点，而且整个转染过程方便可控。>
2、为了达到上述目的，本专利技术第一个方面提供了一种功能化修饰的人轻链铁蛋白，包括插入于n端的功能标签组合，自组装体，以及插入于所述自组装体的亚基的第四和第五α螺旋之间的无序氨基酸序列区域的功能结构域；其中，所述功能标签组合由插入于n端的促进表达的功能结构域和插入于n端的促进纯化的功能结构域组成；所述无序氨基酸序列区域的功能结构域为具有靶向抗炎效果的多肽；所述自组装体为自组装单体经自组装形成的同源二十四聚笼状蛋白。
3、本专利技术利用sumo-tag和his-tag的组合，实现功能化修饰的人轻链铁蛋白的表达和纯化，再通过sumo蛋白酶切除前端功能标签组合，使人轻链铁蛋白具有接近野生型人轻链铁蛋白的原始结构，进而实现其发挥血管炎症的靶向治疗的作用。
4、作为一种优选的实施方式之一，所述功能化修饰的人轻链铁蛋白包括插入于n端的促进纯化的功能结构域为his-tag；插入于n端的促进表达的功能结构域为sumo-tag；天然自组装人轻链铁蛋白亚基的氨基酸序列以及插入于自组装蛋白亚基第四和第五α螺旋之间无序的氨基酸序列区域的功能结构域为靶向vcam-1的vhp肽。
5、优选地，所述无序氨基酸序列区域的功能结构域选自靶向血管细胞黏附分子-1的vhp肽、ghk肽、靶向多种整合素受体的rgd肽，或靶向氨肽酶n (apn/cd13)的 ngr肽中的任一种。
6、优选地，所述人轻链铁蛋白自组装单体为天然人轻链铁蛋白亚基。
7、优选地，所述促进纯化的功能结构域为his-tag；氨基酸序列如seq id no.4所示。
8、优选地，所述促进表达的功能结构域为sumo-tag；氨基酸序列如seq id no.5所示。
9、优选地，所述天然自组装人轻链铁蛋白单亚基氨基酸序列如seq id no.3所示。
10、优选地，所述重组人轻链铁蛋白的氨基酸序列如seq id no.1。
11、优选地，所述无序氨基酸序列区域的功能结构域的氨基酸序列如seq id no.2所示；
12、作为一种优选的实施方式，所述功能化修饰的人轻链铁蛋白还包括通过化学修饰方式将荧光物质连接在所述功能化修饰的人轻链铁蛋白上。
13、作为专利技术的方面之一，本专利技术还提供了一种编码上述的功能化修饰的人轻链铁蛋白的核酸分子。
14、作为专利技术的方面之一，本专利技术还提供了一种重组表达载体内插有如上所述的核酸分子，且，所述表达载体能够在转化或转染宿主细胞后，使被转化或转染的宿主细胞表达上述的功能化修饰的人轻链铁蛋白。
15、作为专利技术的方面之一，本专利技术还提供了一种重组细胞，所述重组细胞包含上述的重组表达载体，或者，所述重组细胞的基因组中整合有上述的核酸分子。
16、优选地，所述重组细胞包括大肠杆菌。
17、作为专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种上述的功能化修饰的人轻链铁蛋白的制备方法，具体步骤包括：
18、以天然人轻链铁蛋白基因序列为模板，构建所述的重组表达载体；将所述重组表达载体转入宿主细胞并进行表达获得重组人轻链铁蛋白融合蛋白；采用sumo蛋白酶酶切去除所述重组人轻链铁蛋白融合蛋白的n端的his-tag的结构域和sumo-tag的结构域；获得所述功能化修饰的人轻链铁蛋白。
19、优选地，所述重组表达载体是经过酶切的pet-30a(+) 质粒与经过酶切的目的序列经酶联而成。
20、优选地，所述重组人轻链铁蛋白融合蛋白的氨基端带有his-tag和sumo-tag，羧基端的第四和第五α螺旋无序区域带有具有靶向抗炎效果的多肽。
21、作为专利技术的方面之一，本专利技术提供一种药物组合物，其有效成分包括如上所述的功能化修饰的人轻链铁蛋白。采用本专利技术的技术方案，通过sumo蛋白酶切除前端标签，使功能化修饰的人轻链铁蛋白与野生型蛋白仅有所需功能肽结构域的差别，因此可消除其他可能的影响的因素。
22、优选地，所述功能化修饰的轻链铁蛋白采用静脉注射的方式给药。
23、作为专利技术的方面之一，本专利技术提供上述的功能化修饰的人轻链铁蛋白在制备抗血管炎症和慢性炎症等相关疾病的药物中应用。
24、本专利技术所获得的有益技术效果：
25、（1）本专利技术技术方案提供的功能化修饰的铁蛋白的促溶表达改造及纯化方法，通过对修饰后铁蛋白的分子水平上进行优化，继而使其在蛋白表达过程中形成上清表达，清除包涵体带来的纯化过程中的蛋白损失，有效提高蛋白回收率，降低生产成本；有效地解决了功能化铁蛋白表达过程中的不稳定等问题，使其在功能修饰的重组蛋白药物和纳米药物递送实现更广泛的应用，尤其是对其他重组蛋白原核表达过程也同样具有重要参考意义。
26、（2）采用本专利技术技术方案，利用sumo-tag和his-tag的功能标签组合，实现抗炎功能化修饰的铁蛋白的上清表达纯化，通过sumo蛋白酶切除前端功能标签组合，使蛋白恢复到接近野生型人轻链铁蛋白的原始结构，并进行血管炎症的靶向治疗。本专利技术方法新颖、调控精准、条件温和，适用于绝大多数原核系统表达过程中易形成包涵体的重组蛋白表达优化，因而具有广阔应用前景。
27、（3）本专利技术提供的功能化修饰的人轻链蛋白的制备方法具有步骤简单、条件温和，解决了人轻链铁蛋白难改造、难表达的技术问题；并且所获得的功能蛋白具有良好的分散性、稳定性和生物安全性，在血管炎症治疗与人本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种重组人轻链铁蛋白，包括插入于N端的功能标签组合，自组装体，以及插入于所述自组装体的亚基的第四和第五α螺旋之间的无序氨基酸序列区域的功能结构域；其中，
2.根据权利要求1的重组人轻链铁蛋白，其特征在于，所述无序氨基酸序列区域的功能结构域选自靶向血管细胞黏附分子-1的VHP肽、GHK肽、靶向多种整合素受体的RGD肽，或靶向氨肽酶N (APN/CD13)的 NGR肽中的任一种；
3.根据权利要求1或2所述的重组人轻链铁蛋白，其特征在于，
4.一种编码如权利要求1-3任一项所述的重组人轻链铁蛋白的核酸分子。
5.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体内插有如权利要求4所述的核酸分子，且，所述表达载体能够在转化或转染宿主细胞后，使被转化或转染的宿主细胞表达权利要求1-3中任一项所述的功能化修饰的人轻链铁蛋白。
6.一种重组人轻链铁蛋白的制备方法，其特征在于，具体步骤包括：
7.一种功能化修饰的人轻链铁蛋白，其特征在于，由如权利要求1所述的重组人链铁蛋白经酶切切去功能标签组合后得到。
8.一种
9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的有效成分包括如权利要求7所述的功能化修饰的人轻链铁蛋白；
10.如权利要求7中任一项所述的功能化修饰的人轻链铁蛋白在制备抗血管炎症和/或慢性炎症相关疾病的药物中应用。
...【技术特征摘要】
1.一种重组人轻链铁蛋白，包括插入于n端的功能标签组合，自组装体，以及插入于所述自组装体的亚基的第四和第五α螺旋之间的无序氨基酸序列区域的功能结构域；其中，
2.根据权利要求1的重组人轻链铁蛋白，其特征在于，所述无序氨基酸序列区域的功能结构域选自靶向血管细胞黏附分子-1的vhp肽、ghk肽、靶向多种整合素受体的rgd肽，或靶向氨肽酶n (apn/cd13)的 ngr肽中的任一种；
3.根据权利要求1或2所述的重组人轻链铁蛋白，其特征在于，
4.一种编码如权利要求1-3任一项所述的重组人轻链铁蛋白的核酸分子。
5.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体内插有如权利要求4所述的核酸分子，且，所述表达...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈光村，曾凡盟，王强斌，杜明明，
申请(专利权)人：中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所，
类型：发明
国别省市：
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