【技术实现步骤摘要】
本申请涉及医药，具体涉及一种利用高压脉冲电场制备细胞外膜囊泡的方法。
技术介绍
1、细胞外膜（plasmalemma，又称细胞质膜或细胞膜）包裹着细胞内的原生质团，维持细胞内环境相对稳定。一些寡聚糖或多糖在细胞外膜的非细胞质侧以共价键的形式与膜脂质或蛋白质结合，形成糖脂和糖蛋白，在细胞外膜的外表面形成细胞外被（cell coat）。生理条件下人体细胞外被的寡聚糖或多糖通常携带负电荷，可以避免细胞在循环系统中被同样携带负电荷的内皮细胞的外被黏连，进而避免被内皮细胞清除或大量吸附在管道内皮细胞表面堵塞管道系统。
2、构成细胞外被上的特异性的排序的寡聚糖或多糖的单糖序列，可成为被其他细胞或蛋白质识别的抗原决定簇（antigenic determinant），也能与递质或激素等结合实现特定功能。细胞外膜表面的分化簇（cluster of differentiation）是不同阶段出现在细胞膜表面的糖蛋白或蛋白质，不仅可作为表面标志用于细胞的鉴定和分离，还广泛参与细胞的生长、成熟、分化、发育、迁移、激活。抗原决定簇或分化簇参与构成细胞外膜上的抗原分子或免疫信号分子。
3、细胞的生物膜系统包括细胞外膜和细胞内膜系统，内膜系统包括内质网、高尔基体、溶酶体、胞内体、分泌泡和外泌体等细胞器的包被膜，内膜系统表面没有细胞外被。
4、以往的研究中往往将细胞团块或组织样本机械研磨或将细胞进行低渗、超声或反复冻融处理以获取细胞生物膜碎片，由细胞生物膜碎片制备细胞膜衍生囊泡，作为载体递送小分子物质或核酸序列，用于肿瘤等疾
5、目前制备细胞膜外膜囊泡的方法尚未见报道。
技术实现思路
1、为了克服以上不足，本申请实施例提供一种利用高压脉冲电场制备细胞外膜囊泡的方法。
2、根据本申请实施例，提供一种利用高压脉冲电场制备细胞外膜囊泡的方法，包括：
3、将活体肿瘤组织标本制备成单细胞悬液；
4、使用单极性高压脉冲电场处理所述单细胞悬液诱导细胞外膜出泡；
5、将出泡的细胞应用双极性高压脉冲电场剥离细胞外膜囊泡；
6、利用特异性磁珠分选磁珠标记特异性蛋白的细胞外膜囊泡；
7、洗脱特异性磁珠以获得特异性细胞外膜囊泡；
8、通过梯度离心浓缩获得预定粒径范围的细胞外膜囊泡。
9、可选的，所述活体肿瘤组织标本是手术切除标本、活检标本或组织液标本。
10、可选的，所述活体肿瘤组织标本的类型是肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、结直肠癌、胰腺癌、神经系统癌症、宫颈癌、鼻咽癌、淋巴瘤、甲状腺癌或前列腺癌。
11、可选的，所述单极性高压脉冲电场是正极性脉冲电场、负极性脉冲电场或差分脉冲电场。
12、可选的，所述单极性高压脉冲电场的强度为1-30 kv/cm，脉冲电场宽度为1纳秒至500微秒，脉冲频率为1 hz到10 khz，脉冲次数1-2000次。。
13、可选的，所述单极性高压脉冲电场的脉冲电场是纳秒脉冲、微秒脉冲或纳秒微秒组合脉冲。
14、可选的，所述双极性高压脉冲电场的正负极性交替出现，正极性与负极性的时间间隔为1微秒至1毫秒。
15、可选的，所述双极性高压脉冲电场的脉冲电压峰峰值是100 v至 10 kv，脉冲电场宽度为1微秒至100微秒，脉冲频率为1 hz到10 khz，脉冲次数1-2000次。
16、在本申请中有两个高压脉冲处理的步骤，第一个脉冲处理是利用单极性高压脉冲电场处理，让细胞外膜外带电电荷的基团朝一个方向运动，致使细胞膜表面出泡；第二个脉冲电场处理是双极性的脉冲电场处理，让细胞膜外带电荷的基团往复运动，第一个步骤中出泡形成的小泡从细胞膜表面剥离（拉扯）下来。
17、可选的，所述特异性磁珠上的特异性标记物是抗人类磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（homosapiens glypican-3，hgpc-3）、抗人类癌胚抗原（homo sapiens carcinoembryonicantigen，hcea）、抗人类程序性死亡受体-1（homo sapiens programmed death receptor-1，hpd-1）、抗程序性死亡配体-1（homo sapiens programmed death ligand-1，hpd-l1）、抗细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白（homo sapiens cytotoxic t lymphocyte associatedantigen-4，ctla-4 ）。这些特异性标记物能够与囊泡表面相应的蛋白多糖或蛋白质特异性结合，通过磁珠分选技术富集分离具有特定分子的囊泡。
18、本申请的实施例提供的技术方案可以包括以下有益效果：
19、由上述实施例可知，本方法由活体肿瘤组织细胞制备的细胞外膜囊泡，与患者个性化免疫配型一致，用于开发特异性抗肿瘤或免疫调节制剂，可避免被免疫细胞非特异性清除。利用单极性高压脉冲电场对细胞外膜表面携带的电荷电场力作用，细胞外被在电场力作用下导致细胞外膜出泡；并进一步利用双极性脉冲电场对细胞外膜上形成的微泡产生往复作用力，剥离这些微泡形成细胞外膜囊泡。其优势在于： 1）利用高压脉冲电场在细胞外被的净电荷上形成电场作用力的特点，制备的细胞外膜囊泡与携带同性电荷的内皮细胞外被之间存在斥力，可以避免细胞外膜囊泡与内皮细胞非特异性吸附，进而被内皮细胞清除吸收甚至导致管道堵塞；2）携带特定抗原分子或免疫信号分子的细胞外膜囊泡，可以与靶细胞上上述分子配体或抗体的特异性结合，从而调控靶细胞的功能；3）纳米级细胞外膜囊泡，可以通过内皮细胞间隙进入组织内部，由携带的特定抗原分子或免疫信号分子将调节信号传递给目标组织内的靶细胞，从而在此基础上开发特定疾病的精准治疗的新方法。
20、应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本申请。
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1.一种利用高压脉冲电场制备细胞外膜囊泡的方法，包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述活体肿瘤组织标本是手术切除标本、活检标本或组织液标本。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述活体肿瘤组织标本的类型是肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、结直肠癌、胰腺癌、神经系统癌症、宫颈癌、鼻咽癌、淋巴瘤、甲状腺癌或前列腺癌。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单极性高压脉冲电场是正极性脉冲电场、负极性脉冲电场或差分脉冲电场。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单极性高压脉冲电场的强度为1-30kV/cm，脉冲电场宽度为1纳秒至500微秒，脉冲频率为1 Hz到10 kHz，脉冲次数1-2000次。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单极性高压脉冲电场的脉冲电场是纳秒脉冲、微秒脉冲或纳秒微秒组合脉冲。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述双极性高压脉冲电场的正负极性交替出现，正极性与负极性的时间间隔为1微秒至1毫秒。
8.根据权利要求1所述的方法，其特
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述特异性磁珠上的特异性标记物是抗人类磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（Homo sapiens Glypican-3，hGPC-3）、抗人类癌胚抗原（Homosapiens carcinoembryonic antigen，hCEA）、抗人类程序性死亡受体-1（Homo sapiensprogrammed death receptor-1，hPD-1）、抗程序性死亡配体-1（Homo sapiens programmeddeath ligand-1，hPD-L1）、抗细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白（Homo sapiens cytotoxic Tlymphocyte associated antigen-4，CTLA-4 ）。
...【技术特征摘要】
1.一种利用高压脉冲电场制备细胞外膜囊泡的方法，包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述活体肿瘤组织标本是手术切除标本、活检标本或组织液标本。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述活体肿瘤组织标本的类型是肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、结直肠癌、胰腺癌、神经系统癌症、宫颈癌、鼻咽癌、淋巴瘤、甲状腺癌或前列腺癌。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单极性高压脉冲电场是正极性脉冲电场、负极性脉冲电场或差分脉冲电场。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单极性高压脉冲电场的强度为1-30kv/cm，脉冲电场宽度为1纳秒至500微秒，脉冲频率为1 hz到10 khz，脉冲次数1-2000次。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单极性高压脉冲电场的脉冲电场是纳秒脉冲、微秒脉冲或纳秒微秒组合脉冲。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述双极性高压脉冲电场的正负极性交替出现，正极性与负极性...
【专利技术属性】
技术研发人员：殷胜勇，刘振，钱俊杰，王昱博，周琳，郑树森，
申请(专利权)人：浙江大学医学院附属第一医院浙江省第一医院，
类型：发明
国别省市：
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