【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及大口黑鲈虹彩病毒检测，具体涉及一种pfago蛋白介导的大口黑鲈虹彩病毒核酸检测试剂盒及其检测方法。
技术介绍
1、大口黑鲈是非常有代表性且发展空间巨大的特色淡水鱼之一，随着大口黑鲈人工繁殖和育苗技术的成功，大口黑鲈养殖业得到较快发展，我国大口黑鲈年养殖产量已突破70万吨，与此同时病害问题也日益严重。大口黑鲈病害主要有病毒病、细菌病和寄生虫病。其中，病毒病流行快、发病率高，并且目前尚无有效控制措施，严重影响大口黑鲈养殖业的发展。在病毒性疫病中，大口黑鲈虹彩病毒(largemouthbass ranavirus，lmbv)最重要的病原之一。lmbv是大口黑鲈养成过程中最重要的病毒性病原，是一种胞质型双链dna病毒，主要感染仔鱼和幼鱼，死亡率超过80％。目前对于大口黑鲈虹彩病毒尚缺乏有效的治疗方法和防控措施，早期检测和诊断是预防该病爆发的关键环节。因此，开发新的病毒检测技术具有重要应用价值。
2、目前大口黑鲈感染lmbv的主要诊断方法有临床症状诊断、病毒分离培养、电镜检测、免疫学检测以及核酸检测。目前核酸检测主要以rt-qpcr为主，但是面临着设计复杂、操作繁琐和仪器昂贵的问题。近年来，随着以crispr/cas9为代表的新型基因编辑技术的出现并广泛应用于病原微生物等的检测，使得传统分子诊断技术迈入了低成本、高灵敏性、高特异性的新型分子诊断阶段。其中，用于lmbv病毒的新型检测系统raa-crispr/cas13法也已成功建立，但该方法需要先进行重组酶辅助扩增(raa)扩增，然后再利用crispr/cas13
技术实现思路
1、本专利技术的目的是为了克服现有技术存在的crispr/cas系统中grna的合成费用昂贵、灵敏度仍有待提升的问题，提供一种pfago蛋白介导的大口黑鲈虹彩病毒核酸检测试剂盒及其检测方法。
2、为了实现上述目的，本专利技术一方面提供一种大口黑鲈虹彩病毒核酸检测试剂盒，该试剂盒包含pfago蛋白、扩增引物对、gdna和分子信标；
3、其中，所述gdna包含序列如seq id no:7所示的g6和序列如seq id no:19所示的g6-1；
4、所述扩增引物对为序列如seq id no:21～22所示的引物对或seq id no:23～24所示的引物对；
5、所述分子信标的序列如seq id no:66所示。
6、本专利技术第二方面提供一种pfago蛋白介导的lmbv病毒核酸检测方法，该方法包括以下步骤：
7、(1)使用seq id no:21～22所示的引物对或seq id no:23～24所示的引物对对待测样品扩增得到tdna；
8、(2)构建包含5’磷酸化的gdna、pfago蛋白、所述tdna、pfago反应缓冲液和分子信标的反应体系，然后进行切割反应；
9、(3)反应结束后，对上述反应体系进行荧光检测；
10、所述gdna包含序列如seq id no:7所示的g6和序列如seq id no:19所示的g6-1；
11、所述分子信标的序列如seq id no:66所示。
12、本专利技术第三方面提供了如上所述的试剂盒在鉴定或辅助鉴定lmbv病毒中的应用。
13、本专利技术提供的pfago蛋白介导的大口黑鲈虹彩病毒检测试剂盒，含有经筛选和优化得到的gdna(向导dna)，相比于cas13a系统的向导rna，该向导ssdna不仅能方便、稳定的获得，而且具有成本优势；同时，通过选用特定序列的gdna，不仅增加了检测的灵敏度，也减少了实验过程中gdna的用量，更降低减少了实验过程中必要的5’磷酸化反应程序，从而降低检测的成本，减少费时费力的繁杂过程。
14、本专利技术提供的基于上述试剂盒的检测方法，与pcr技术联用后，待检测的lmbv低至1.0copy/μl时仍能被检测到，其检测灵敏度超过了raa-crispr/cas13法。
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1.一种PfAgo蛋白介导的大口黑鲈虹彩病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含PfAgo蛋白、扩增引物对、gDNA和分子信标；
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述分子信标带有荧光基团和猝灭基团。
3.一种PfAgo蛋白介导的LMBV病毒核酸检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述PfAgo反应缓冲液包含HEPES、氯化钠和氯化锰。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述反应体系中，使用的是10×PfAgo反应缓冲液，其中，所述PfAgo反应缓冲液包含：150～250mM HEPES，2～3M氯化钠和20～30mM氯化锰。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述PfAgo反应缓冲液中，HEPES的pH为7.5～8.5。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，切割反应的条件包括：温度为93～98℃，时间为20～40min。
8.权利要求1或2所述的试剂盒在鉴定或辅助鉴定LMBV病毒中的应用。p>...
【技术特征摘要】
1.一种pfago蛋白介导的大口黑鲈虹彩病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含pfago蛋白、扩增引物对、gdna和分子信标；
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述分子信标带有荧光基团和猝灭基团。
3.一种pfago蛋白介导的lmbv病毒核酸检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述pfago反应缓冲液包含hepes、氯化钠和氯化锰。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于...
【专利技术属性】
技术研发人员：何如怡，张楷文，张辰辰，何弯弯，刘志国，李玥佳，
申请(专利权)人：武汉轻工大学，
类型：发明
国别省市：
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