【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，涉及基于pei40000的促进鱼体外源基因瞬时过表达的方法，还涉及pei40000在增强鱼类出血病病毒dna疫苗保护率中的应用。
技术介绍
1、由于鱼类养殖业的快速发展，相应的病毒性疾病和细菌性疾病也日益严重。众所周知，疫苗是细菌和病毒防控的最佳手段。然而鱼类疫苗的发展则远不如哺乳类动物疫苗发展的迅速，在生产和应用中，高效、安全、经济的鱼类疫苗较为少见。dna疫苗是一种新型疫苗，通过将编码病原体抗原蛋白的基因直接注入宿主体内，利用宿主细胞的表达系统产生抗原蛋白，从而激发免疫反应。与传统疫苗相比，dna疫苗具有生产成本低、稳定性好、易于储存和运输、免疫效果持久等优点。dna疫苗的主要挑战在于提高其免疫原性，因为裸dna在体内的表达水平可能较低。在实际应用中，可以通过提高dna的转染效率，或者结合使用分子佐剂(如cpg odns)来增强免疫反应。dna疫苗的研究正在不断进展，包括优化抗原基因的表达、使用不同的递送系统(如纳米粒子、微球)和开发新的分子佐剂。
2、svcv(鲤春病毒血症病毒)是一种对鲤科鱼类造成严重威胁的病毒，能够引起急性、高致死性的传染病，给水产养殖业带来巨大的经济损失。该病毒在欧洲、美洲、亚洲广泛传播，并已被世界动物卫生组织(oie)列为必须申报的疾病。svcv感染的鱼类可表现为出血、器官损伤和高死亡率，病毒的传播途径包括水体、饵料以及鱼类的直接接触。病毒的基因组全长约为11,000bp，包含5个主要的开放阅读框(orfs)，分别编码5种结构蛋白：核蛋白(n)、磷蛋白(p)、
3、众所周知，疫苗是控制病毒病的常用且高效的手段。近年来，为了应对病毒对水产养殖带来的巨大经济损失这一严峻的形势，国内外学者开发了很多鱼类病毒病防控疫苗。其中，在鱼类出血病毒疫苗研发方面，也取得了一些进展。例如，利用原核表达系统成功表达了svcv的g蛋白，并制备了特异性单克隆抗体，这些单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高的特点，可应用于开发各种诊断试剂，为建立新型svcv免疫学诊断方法提供了工具。gcrv灭活疫苗也被投入使用。然而，尽管这些应对鱼类出血病毒的疫苗被研发出来，但这些疫苗都因其保护率和安全性等问题未被广泛地接受和使用。
4、聚乙烯亚胺(pei)可用作非病毒合成聚合物载体，用于治疗性核酸的体内输送。目前已经验证线性pei转染试剂广泛适用于多种细胞系包括hek-293、hek293t、cho-k1、cos-1、cos-7、nih/3t3、sf9、hepg2和hela细胞等，转染效率高达80％-90％。线性聚乙烯亚胺40000(pei40000)是一种分子量为40000的高电荷阳离子聚合物，容易结合带负电荷的核酸分子，形成复合物，并使该复合物进入细胞中。与常见的pei25000相比，pei40000具有很多优点，包括：pei40000较易溶解，可直接在水中溶解，pei 25000需要先把水调成弱酸性助其溶解，溶解后再用naoh把ph调至中性；pei40000操作简便，更易于使用，且比pei25000的转染效果好；pei25000含有4-11％的丙酰基残留，其能阻止聚合物主链与dna结合；相较于pei25000，pei40000是完全脱落的结构，因此其性能始终高效如一，然而，目前将其应用于疫苗开发的研究很少，特别是尚未见其被用于鱼类病毒的dna疫苗研究。
5、提高dna疫苗的免疫效率是dna疫苗研发的关键。一方面可以通过不断筛选dan序列，最大可能地提高其免疫原性；另一方面则是提高其疫苗递送能力；再者则可使用疫苗佐剂，提高疫苗的保护率。其中，白细胞介素(il-2、il-4、il-5、il-7、il-12)、干扰素(ifn)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)等细胞因子具有免疫佐剂作用，选择合适的细胞因子作为核酸疫苗的佐剂可有效提高免疫效果。而脂质体佐剂和纳米佐剂也被证明可显著增强dna疫苗的免疫性。在这里我们首次发现pei40000可作为添加剂，显著提高病毒疫苗的保护效率。
技术实现思路
1、本专利技术的第一个目的在于提供基于pei40000的促进鱼体外源基因瞬时过表达的方法。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：使用pei40000试剂包裹外源质粒通过注射方式进入鱼体，从而实现瞬时过表达；具体步骤为：
3、1)配制pei40000母液
4、将pei40000在常温下溶解于超纯水中，得到的pei40000水溶液用氢氧化钠溶液调节ph至6.5-7.0，过滤后定容至pei40000浓度为0.5-1.2mg/ml的pei40000母液，分装后2～6℃保存；
5、2)配制pei40000试剂
6、取步骤1)得到的pei40000母液1-6μl用ph为7.2-7.4的pbs溶液稀释至50μl，得到pei40000浓度为0.006～0.042μg/μl的pei40000试剂；
7、3)外源质粒试剂制备
8、将一个或多个外源目的基因用ph为7.2-7.4的pbs溶液混匀得到外源质粒试剂；
9、4)促表达
10、取步骤2)的pei40000试剂与步骤3)制备得到的外源质粒试剂混合，通过腹腔或肌肉注射鱼体，注射后12h开始喂食，注射后1-10天均产生显著促进过表达的效果。
11、作为本专利技术的优选，所述外源目的基因包括tbk1(tank结合激酶1)和/或irf5(干扰素调节因子5)。
12、优选地，所述注射方式包括腹腔注射和肌肉注射。
13、优选地，所述pei40000水溶液用氢氧化钠(0.5-2mol/l)溶液调节ph至6.8。
14、优选地，所述pei40000水溶液用0.1-0.45μm针头式滤器过滤。
15、优选地，所述pei40000水溶液浓度为0.5-1.2mg/ml时放置于2-6℃保存。
16、优选地，鱼体与外源质粒试剂的比例为1g：0.5μg～1μg。
17、优选地，外源质粒试剂与pei40000的比例为1μg：1μg～3μg。
18、本专利技术的另一个目的是提供pei40000在增强鱼类出血病病毒dna疫苗保护率中的应用；包括如下步骤：
19、1)配制pei40000母液
20、将pei40000在常温下溶解于超纯水中，得到的pei40000水溶液用氢氧化钠溶液调节ph至本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.基于PEI40000的促进鱼体外源基因瞬时过表达的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4)中通过腹腔或肌肉注射鱼体时，鱼体与外源质粒试剂的比例为1g：0.5μg～1μg；所述外源质粒试剂与PEI40000试剂的比例为1μg：1μg～3μg。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述外源目的基因是TBK1和/或IRF5。
4.PEI40000在制备增强鱼类出血病病毒DNA疫苗保护率的佐剂时的应用。
5.一种增强鱼类出血病病毒DNA疫苗保护率的佐剂，其特征在于，包括PEI40000。
6.PEI40000在增强鱼类出血病病毒DNA疫苗保护率中的应用，其特征在于，包括如下步骤：
7.根据权利要求6所述的PEI40000在增强鱼类出血病病毒DNA疫苗保护率中的应用，其特征在于，所述鱼类出血病病毒是鲤春病毒血症病毒SVCV或草鱼呼肠孤病毒GCRV。
【技术特征摘要】
1.基于pei40000的促进鱼体外源基因瞬时过表达的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4)中通过腹腔或肌肉注射鱼体时，鱼体与外源质粒试剂的比例为1g：0.5μg～1μg；所述外源质粒试剂与pei40000试剂的比例为1μg：1μg～3μg。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述外源目的基因是tbk1和/或irf5。
4.pei40000在制...
【专利技术属性】
技术研发人员：阳灿，吴浩，熊珍珍，高金伟，宋锐，吴艳芳，杨晴，陈飞洺，欧东升，谢仲桂，
申请(专利权)人：湖南省水产科学研究所，
类型：发明
国别省市：
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