System.ArgumentOutOfRangeException: 索引和长度必须引用该字符串内的位置。 参数名: length 在 System.String.Substring(Int32 startIndex, Int32 length) 在 zhuanliShow.Bind() 一种表达CD300LD的低免疫原性细胞及其制备方法技术_技高网

一种表达CD300LD的低免疫原性细胞及其制备方法技术

技术编号:44166526 阅读:5 留言:0更新日期:2025-01-29 10:40
本发明专利技术提供了一种表达CD300LD的低免疫原性细胞及其制备方法。所述低免疫原性多能细胞能在不改变干细胞更新及分化特性的同时,显著减少或逃逸免疫系统的识别和攻击,尤其是T细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞等的攻击。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程与干细胞,具体涉及一种表达cd300ld的低免疫原性细胞及其制备方法。


技术介绍

1、干细胞是一类具备自我更新能力以及向特定功能体细胞分化能力的细胞,依据干细胞特性的程度差异,主要将干细胞分为:全能干细胞、多能干细胞和成体干细胞。诱导性多能干细胞(ipsc)具有无限增殖、自我更新和分化到各种类型细胞的潜力,在治疗癌症、神经相关、心血管等疾病具有重要应用前景。但是免疫不相容和移植细胞遭受的免疫排斥等关键问题阻碍了移植异体功能细胞进行治疗的临床应用。

2、人主要组织相容性复合体(mhc),即人白细胞抗原(hla),是导致免疫不相容的主要原因。mhc由一系列基因组成,可分为i类、ii类和iii类。mhc-i基因在几乎所有的组织细胞类型中表达,表达“非己”mhc-i类分子的移植细胞将刺激cd8+t细胞的活化而被消除。cd4+辅助t细胞识别“非己”细胞的mhc-ii基因,从而进行免疫排斥,而iii类分子不参与免疫活动。

3、近年已有报道通过敲除b2m、ciita等基因,可以实现mhc-i和mhc-ii细胞表面或本身基因的缺失表达,进而使细胞具备免疫耐受或逃逸t细胞/b细胞特异性免疫应答,产生免疫兼容的低免疫原性多能干细胞。

4、cd300ld又名cd300d,是i型膜蛋白,具有单个胞外igv型结构域。短胞质尾部缺乏任何已知的信号基序,但跨膜结构域内有一个带负电荷的残基(谷氨酸)。可启用跨膜信号受体活性和病毒受体活性,参与免疫系统过程。


技术实现思路>

1、针对现有技术所存在的不足,本专利技术提供了改造细胞获得低免疫原性的新方法,首次采取将涉及到母胎耐受和肿瘤逃逸的各机制分子进行大批量筛选的策略,通过多轮功能检测,最终鉴定出了代表性的新基因cd300ld。该基因能够显著减少或逃逸免疫系统的识别和攻击,尤其是自然杀伤细胞、t细胞、巨噬细胞等的攻击,本专利技术提出了通过不可预料的领域转化开发新基因实现细胞的免疫豁免性的可行策略。

2、本专利技术通过敲除人多能干细胞内质网中β-2-微球蛋白(b2m)和敲除mhc-ii基因转录的正调节因子ciita,成功构建b2m/ciita双等位基因敲除阳性克隆dko细胞;然后使用慢病毒载体在dko细胞中过表达本专利技术鉴定出的新基因cd300ld,由此获得的人多能干细胞可在逃逸t细胞攻击的基础上,进一步逃逸nk细胞的杀伤。同时这些低免疫原性的多能干细胞保留了其干性和分化能力等多能干细胞的关键生物学功能。

3、为了实现上述目的,本专利技术采用如下技术方案:

4、在一方面,本专利技术提供一种低免疫原性多能干细胞,其包含:与亲本多能干细胞相比降低的内源主要组织相容性i类抗原(mhc-i)功能;与亲本多能干细胞相比降低的内源主要组织相容性ii类抗原(mhc-ii)功能;和与亲本多能干细胞相比降低的对nk细胞和t细胞杀伤的敏感性,其中所述降低的对nk细胞和t细胞杀伤的敏感性是由增加的cd300ld蛋白的表达引起的。

5、在一些实施方案中,所述mhc-i功能通过降低mhc-i类蛋白或mhc-i转录调节因子的活性而降低。

6、在一实施方案中,所述mhc-i类蛋白包含hla-a蛋白、hla-b蛋白或hla-c蛋白。

7、在一实施方案中,所述mhc-i转录调节因子包含b2m蛋白、tap1蛋白、tap2蛋白、tap相关糖蛋白或nlrc5蛋白。

8、在一实施方案中,所述mhc-i功能通过降低b2m蛋白的活性而降低。

9、在一实施方案中,所述b2m蛋白为人b2m蛋白,其包含如seq id no:1所示的氨基酸序列或与seq id no:1所示的氨基酸序列具有90%相同性的氨基酸序列。

10、在一实施方案中,所述mhc-ii功能通过降低mhc-ii类蛋白或mhc-ii转录调节因子的活性而降低。

11、在一实施方案中,所述mhc-ii类蛋白包含hla-dr蛋白、hla-dq蛋白或hla-dp蛋白。

12、在一实施方案中,所述mhc-ii转录调节因子包含ciita2蛋白、rfxank蛋白、rfx5蛋白或rfxap蛋白。

13、在一实施方案中,所述mhc-ii功能通过降低ciita蛋白的活性而降低。

14、在一实施方案中,所述ciita蛋白为人ciita蛋白,其包含如seq id no:2所示的氨基酸序列或与如seq id no:2所示的氨基酸序列具有90%相同性的氨基酸序列。

15、在一些实施方案中,所述cd300ld蛋白为人cd300ld蛋白,其包含如seq id no:3所示的氨基酸序列或与如seq id no:3所示的氨基酸序列具有90%相同性的氨基酸序列。

16、在一些实施方案中,所述cd300ld蛋白为人cd300ld蛋白,其包含如seq id no:4所示的氨基酸序列或与如seq id no:4所示的氨基酸序列具有90%相同性的氨基酸序列。

17、在一实施方案中,所述低免疫原性多能干细胞包含:使内源b2m蛋白活性降低的一个或多个改变;使内源ciita蛋白活性降低的一个或多个改变;和在所述低免疫原性多能干细胞中引起增加的cd300ld蛋白表达的一个或多个改变。

18、在一实施方案中,所述低免疫原性多能干细胞还包括增加以下多肽的表达的一个或多个改变,增加表达的多肽选自:dux4、cd27、cd35、cd200、hla-c、pd-l1、cd47、cd24、cd26、ccl21、mfge8和serpinb9。

19、在一实施方案中,所述低免疫原性多能干细胞包含:使内源b2m基因的两个等位基因失活的一个或多个改变;使内源ciita基因的两个等位基因失活的一个或多个改变;

20、和在所述低免疫原性多能干细胞中引起增加的cd300ld基因表达的一个或多个改变。

21、在另一方面,本专利技术还提供一种产生本专利技术上述低免疫原性多能干细胞的方法,所述方法包括:降低所述多能干细胞中内源主要组织相容性i类抗原(mhc-i)功能;降低所述多能干细胞中内源主要组织相容性ii类抗原(mhc-ii)功能;和增加降低所述多能干细胞对nk细胞和t细胞杀伤的敏感性的蛋白的表达,其中所述蛋白为cd300ld蛋白。

22、在一实施方案中,所述方法包括:降低所述多能干细胞中b2m蛋白的活性;降低所述多能干细胞中ciita蛋白的活性;和增加所述多能干细胞中cd300ld蛋白的表达。

23、在一实施方案中,所述方法包括:消除所述多能干细胞中b2m基因的两个等位基因的活性;消除所述多能干细胞中ciita基因的两个等位基因的活性;和增加所述多能干细胞中cd300ld基因的表达。

24、在一实施方案中,所述方法还包括:增加所述多能干细胞中至少一种选自:dux4、cd27、cd35、cd200、hla-c、pd-l1、cd47、cd24、cd26、ccl21、mfge8本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种低免疫原性多能干细胞,其包含:

2.如权利要求1所述的低免疫原性多能干细胞,其特征在于,所述低免疫原性多能干细胞还包括修饰以增加以下一种或多种多肽的表达:DUX4、CD27、CD35、CD200、HLA-C、PD-L1、CD47、CD24、CD26、CCL21、Mfge8和SerpinB9。

3.如权利要求1或2所述的低免疫原性多能干细胞,其中所述MHC-I功能通过降低MHC-I类蛋白或MHC-I转录调节因子的活性而降低。

4.如权利要求3所述的低免疫原性多能干细胞,其中所述MHC-I类蛋白包含HLA-A蛋白、HLA-B蛋白或HLA-C蛋白。

5.如权利要求3所述的低免疫原性多能干细胞,其中所述MHC-I转录调节因子包含B2M蛋白、TAP1蛋白、TAP2蛋白、TAP相关糖蛋白或NLRC5蛋白。

6.如权利要求3所述的低免疫原性多能干细胞,其中所述MHC-I功能通过降低B2M蛋白的活性而降低。

7.如权利要求6所述的低免疫原性多能干细胞,其中所述B2M蛋白为人B2M蛋白,其包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少90%相同性的氨基酸序列。

8.如权利要求1-7中任一项所述的低免疫原性多能干细胞,其中所述MHC-II功能通过降低MHC-II类蛋白或MHC-II转录调节因子的活性而降低。

9.如权利要求8所述的低免疫原性多能干细胞,其中所述MHC-II类蛋白包含HLA-DR蛋白、HLA-DQ蛋白或HLA-DP蛋白。

10.如权利要求8所述的低免疫原性多能干细胞,其中所述MHC-II转录调节因子包含CIITA2蛋白、RFXANK蛋白、RFX5蛋白或RFXAP蛋白。

11.如权利要求8所述的低免疫原性多能干细胞,其中所述MHC-II功能通过降低CIITA蛋白的活性而降低。

12.如权利要求11所述的低免疫原性多能干细胞,其中所述CIITA蛋白为人CIITA蛋白,其包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少90%相同性的氨基酸序列。

13.如权利要求1-12中任一项所述的低免疫原性多能干细胞,其中所述CD300LD蛋白为人CD300LD蛋白,其包含序列如SEQ ID NO:3或4所示的氨基酸序列或与如SEQ ID NO:3或4所示的氨基酸序列具有至少90%相同性的氨基酸序列。

14.如权利要求1所述的低免疫原性多能干细胞,其包含:

15.如权利要求14所述的低免疫原性多能干细胞,其包含:

16.一种产生权利要求1-15中任一项所述的低免疫原性多能干细胞的方法,所述方法包括:

17.如权利要求16所述的方法,所述方法包括:

18.如权利要求17所述的方法,所述方法包括:

19.如权利要求16-18中任一项所述的方法,其特征在于,所述低免疫原性多能干细胞还表达选自DUX4、CD27、CD35、CD200、HLA-C、PD-L1、CD47、CD24、CD26、CCL21、Mfge8和SerpinB9中的一种或多种的基因序列。

20.如权利要求16-19中任一项所述的方法,其中通过选自以下的技术降低所述多能干细胞中B2M蛋白的活性和/或降低所述多能干细胞中CIITA蛋白的活性:

21.如权利要求20所述的方法,其中通过成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas9基因编辑技术降低所述多能干细胞中B2M蛋白的活性;和/或通过成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas9基因编辑技术降低所述多能干细胞中CIITA蛋白的活性。

22.如权利要求16-20中任一项所述的方法,其中通过对内源基因座的修饰增加CD300LD蛋白的表达。

23.如权利要求16-20中任一项所述的方法,其中通过转基因的表达增加CD300LD蛋白的表达;优选地,通过合成编码CD300LD蛋白的核酸序列,以构建至慢病毒载体中,再通过慢病毒载体,将至少一个拷贝的在启动子控制下的CD300LD基因引入所述多能干细胞中增加CD300LD蛋白的表达。

24.如权利要求23所述的方法,其中所述编码CD300LD蛋白的核酸序列包含如SEQ IDNO:25所示的核酸序列或与如SEQ ID NO:25所示的核酸序列具有至少80%相同性的核酸序列。

25.如权利要求23所述的方法,其中所述编码CD300LD蛋白的核酸序列包含如SEQ IDNO:26所示的核酸序列或与如SEQ ID NO...

【技术特征摘要】

1.一种低免疫原性多能干细胞,其包含:

2.如权利要求1所述的低免疫原性多能干细胞,其特征在于,所述低免疫原性多能干细胞还包括修饰以增加以下一种或多种多肽的表达:dux4、cd27、cd35、cd200、hla-c、pd-l1、cd47、cd24、cd26、ccl21、mfge8和serpinb9。

3.如权利要求1或2所述的低免疫原性多能干细胞,其中所述mhc-i功能通过降低mhc-i类蛋白或mhc-i转录调节因子的活性而降低。

4.如权利要求3所述的低免疫原性多能干细胞,其中所述mhc-i类蛋白包含hla-a蛋白、hla-b蛋白或hla-c蛋白。

5.如权利要求3所述的低免疫原性多能干细胞,其中所述mhc-i转录调节因子包含b2m蛋白、tap1蛋白、tap2蛋白、tap相关糖蛋白或nlrc5蛋白。

6.如权利要求3所述的低免疫原性多能干细胞,其中所述mhc-i功能通过降低b2m蛋白的活性而降低。

7.如权利要求6所述的低免疫原性多能干细胞,其中所述b2m蛋白为人b2m蛋白,其包含如seq id no:1所示的氨基酸序列或与如seq id no:1所示的氨基酸序列具有至少90%相同性的氨基酸序列。

8.如权利要求1-7中任一项所述的低免疫原性多能干细胞,其中所述mhc-ii功能通过降低mhc-ii类蛋白或mhc-ii转录调节因子的活性而降低。

9.如权利要求8所述的低免疫原性多能干细胞,其中所述mhc-ii类蛋白包含hla-dr蛋白、hla-dq蛋白或hla-dp蛋白。

10.如权利要求8所述的低免疫原性多能干细胞,其中所述mhc-ii转录调节因子包含ciita2蛋白、rfxank蛋白、rfx5蛋白或rfxap蛋白。

11.如权利要求8所述的低免疫原性多能干细胞,其中所述mhc-ii功能通过降低ciita蛋白的活性而降低。

12.如权利要求11所述的低免疫原性多能干细胞,其中所述ciita蛋白为人ciita蛋白,其包含如seq id no:2所示的氨基酸序列或与如seq id no:2所示的氨基酸序列具有至少90%相同性的氨基酸序列。

13.如权利要求1-12中任一项所述的低免疫原性多能干细胞,其中所述cd300ld蛋白为人cd300ld蛋白,其包含序列如seq id no:3或4所示的氨基酸序列或与如seq id no:3或4所示的氨基酸序列具有至少90%相同性的氨基酸序列。

14.如权利要求1所述的低免疫原性多能干细胞,其包含:

15.如权利要求14所述的低免疫原性多能干细胞,其包含:

16.一种产生权利要求1-15中任一项所述的低免疫原性多能干细...

【专利技术属性】
技术研发人员:请求不公布姓名请求不公布姓名
申请(专利权)人:士泽生物医药苏州有限公司
类型:发明
国别省市:

网友询问留言 已有0条评论
  • 还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。

1