【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于抗体工程领域，具体涉及一种亲和力成熟的抗丙烯酰胺衍生物纳米抗体突变体及其应用。
技术介绍
1、丙烯酰胺(acrylamide)，是一种无色无味的白色晶体，其化学式为c3h5no。食品中的还原糖会与游离氨基酸在高温反应下形成丙烯酰胺，其广泛的存在于面包、饼干和咖啡等烘焙类食品中。丙烯酰胺具有致癌性，被国际卫生组织划为2a级致癌物，对人体具有潜在的毒害作用，同时，过量摄入丙烯酰胺会导致人体的生殖系统发育异常，造成精子的数量和质量下降，丙烯酰胺还会对人体的神经系统造成影响，干扰神经细胞间的正常通讯，使神经系统内部离子浓度失调。因此，加强对食品中丙烯酰胺含量的检测十分必要。
2、目前，国内外针对食品中丙烯酰胺的检测方法主要为气相色谱-质谱法和光谱分析法等仪器分析方法，仪器分析方法虽准确但成本较高且不适用于现场的大规模检测。近年来，免疫分析方法因其简便、快捷及灵敏度高等优势已经广泛应用于食品中有毒有害物质的检测。免疫分析方法的核心试剂是抗体，多克隆抗体及单克隆抗体因其稳定性较差和产量较低的原因，限制了在免疫检测中的应用发展。纳米抗体是指存在于驼科动物体内天然缺乏轻链的重链抗体可变区，其分子量较小，仅为传统抗体大小的1/10，是目前最小的抗原结合片段。纳米抗体相较于传统抗体，其稳定性更强，具有优异的热稳定性和有机溶剂耐受性，能够在高温处理后以及在一定浓度的有机溶剂中保持良好的抗原结合能力。因纳米抗体结构域简单，易于通过基因工程改造使抗体的亲和力提升。
3、但目前能够应用于检测丙烯酰胺的高灵敏度的纳米抗体
技术实现思路
1、本专利技术要解决的技术问题是克服现有抗丙烯酰胺衍生物的纳米抗体的缺陷和不足，提供一种亲和力成熟的抗丙烯酰胺衍生物纳米抗体及其应用。
2、本专利技术的第一个目的是提供一种亲和力成熟的抗丙烯酰胺衍生物纳米抗体突变体。
3、本专利技术的第二个目的是提供一种编码抗丙烯酰胺衍生物的纳米抗体突变体的基因。
4、本专利技术的第三个是提供亲和力成熟的抗丙烯酰胺衍生物纳米抗体突变体的应用。
5、本专利技术的第四个是提供一种重组表达载体。
6、本专利技术的第五个是提供一种重组表达细胞。
7、本专利技术的第六个是提供一种检测丙烯酰胺的方法。
8、本专利技术的第七个是提供一种检测丙烯酰胺衍生物的试剂盒。
9、本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：
10、本专利技术在野生型抗丙烯酰胺衍生物纳米抗体3g的基础上，进行同源建模及分子对接，确定纳米抗体与丙烯酰胺衍生物的关键识别位点，采用定点饱和突变技术构建抗体突变库，并进一步通过噬菌体展示及生物淘筛技术对野生型抗丙烯酰胺衍生物纳米抗体3g进行了亲和力成熟，获得了一种对丙烯酰胺衍生物亲和力相较于野生型纳米抗体3g更高的纳米抗体突变体1c1，抗丙烯酰胺衍生物纳米抗体突变体1c1为野生型纳米抗体3g的第26、28、30、32、76位氨基酸分别突变为gly26、arg28、asp30、trp32、pro76。纳米抗体突变体1c1的ic50为0.81μg/ml，相较于野生型纳米抗体提高了55％，最低检测限为0.052μg/ml，线性范围为0.172-9.793μg/ml；纳米抗体突变体1c1在40％甲醇浓度下能保持70％的活性，相比于野生型提高了1倍；能特异性识别丙烯酰胺衍生物，相比野生型纳米抗体的灵敏度提高了55％，针对前处理试剂甲醇的耐受性更好，稳定性更强，应用于酶联免疫分析方法时中检测结果准确、稳定性高，对于检测食品中丙烯酰胺的含量具有重要意义。
11、进一步地，野生型抗丙烯酰胺衍生物纳米抗体3g的氨基酸序列如seq id no.3所示：evqleqsgggpvqaggslrlsctaseytrinycmgwvrqapgke rervagfgtggstryadsvkgrftisqdnakrtlylemnslkpedtamyyc aaracwsntytywgqgtlvtvss。
12、进一步地，抗丙烯酰胺衍生物纳米抗体突变体1c1的氨基酸序列如seq id no.1所示：evqleqsgggpvqaggslrlsctasgyrrdnwcmgwvrqap gkerervagfgtggstryadsvkgrftisqdnakptlylemnslkpedtamy ycaaracwsntytywgqgtlvtvss。
13、本专利技术提供一种编码抗丙烯酰胺衍生物的纳米抗体突变体1c1的基因，其核苷酸序列如seq id no.2所示。
14、本专利技术提供所述亲和力成熟的抗丙烯酰胺衍生物纳米抗体突变体1c1在检测丙烯酰胺衍生物中的应用。
15、本专利技术提供所述亲和力成熟的抗丙烯酰胺衍生物纳米抗体突变体1c1在制备检测丙烯酰胺衍生物的产品中的应用。
16、本专利技术还提供一种重组表达载体，含编码抗丙烯酰胺衍生物的纳米抗体突变体1c1的基因。
17、本专利技术还提供一种重组表达细胞，含有上述重组载体。
18、本专利技术还提供上述重组表达载体或重组表达细胞在丙烯酰胺检测或制备检测丙烯酰胺检测试剂盒的应用。
19、本专利技术还提供一种检测丙烯酰胺的方法，采用亲和力成熟的抗丙烯酰胺衍生物纳米抗体突变体1c1进行检测。
20、进一步地，采用酶联免疫分析方法进行检测。
21、优选地，采用间接酶联免疫检测。
22、更优选的，使用亲和力成熟的抗丙烯酰胺衍生物纳米抗体突变体1c1，以丙烯酰胺衍生物人工抗原为包被原，进行酶联免疫检测。
23、优选地，所述丙烯酰胺衍生物人工抗原为全抗原xaa-309-ova，由半抗原xaa-309与卵清蛋白ova(albumin)通过活泼酯法偶联制备得到。
24、进一步地，半抗原xaa-309的结构式为：
25、
26、作为最优选地的实施方案，具体检测方法为：
27、s1.制备包被含丙烯酰胺衍生物完全抗原地酶标板；
28、s2.将丙烯酰胺标准品使用过量衍生剂进行衍生，衍生物标准品或待测样品加入酶标板微孔中，然后加入所述纳米抗体
29、s3.加入酶标记的二抗，孵育；
30、s4.加入显色液，孵育；
31、s5.加入终止液并测定；
32、s6.以药物标准浓度的log10值为横坐标，以各标准品浓度的吸光值与零标准孔吸光值的比值为纵坐标，建立标准曲线，进而根据待测样品的吸光值来计算待测样品中的丙烯酰胺的含量。
33、本专利技术还提供一种检测丙烯酰胺衍生本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种亲和力成熟的抗丙烯酰胺衍生物纳米抗体突变体1C1，其特征在于，所述抗丙烯酰胺衍生物纳米抗体突变体1C1为野生型纳米抗体3G的第26、28、30、32、76位氨基酸分别突变为Gly26、Arg28、Asp30、Trp32、Pro76；所述野生型抗丙烯酰胺衍生物纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述纳米抗体突变体1C1，其特征在于，所述抗丙烯酰胺衍生物纳米抗体突变体1C1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.一种编码抗丙烯酰胺衍生物纳米抗体突变体1C1的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.权利要求1或2所述亲和力成熟的抗丙烯酰胺衍生物纳米抗体突变体1C1在检测丙烯酰胺中的应用。
5.权利要求1或2所述亲和力成熟的抗丙烯酰胺衍生物纳米抗体突变体1C1在制备检测丙烯酰胺的产品中的应用。
6.一种重组表达载体，其特征在于，含权利要求3所述基因。
7.一种重组表达细胞，其特征在于，含权利要求6所述重组载体。
8.一种检
9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，采用酶联免疫分析方法进行检测。
10.一种检测丙烯酰胺衍生物的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1或2所述亲和力成熟的抗丙烯酰胺衍生物纳米抗体突变体1C1。
...【技术特征摘要】
1.一种亲和力成熟的抗丙烯酰胺衍生物纳米抗体突变体1c1，其特征在于，所述抗丙烯酰胺衍生物纳米抗体突变体1c1为野生型纳米抗体3g的第26、28、30、32、76位氨基酸分别突变为gly26、arg28、asp30、trp32、pro76；所述野生型抗丙烯酰胺衍生物纳米抗体的氨基酸序列如seq id no.3所示。
2.根据权利要求1所述纳米抗体突变体1c1，其特征在于，所述抗丙烯酰胺衍生物纳米抗体突变体1c1的氨基酸序列如seq id no.1所示。
3.一种编码抗丙烯酰胺衍生物纳米抗体突变体1c1的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
4.权利要求1或2所述亲和力成熟的抗丙烯酰胺衍生...
【专利技术属性】
技术研发人员：王弘，李嘉伟，徐振林，罗林，肖治理，杨金易，沈玉栋，孙远明，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：
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