【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药，具体涉及一种具有即时祛皱功效的μ-芋螺毒素kiiia的水基合成方法。
技术介绍
1、公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
2、芋螺毒素源自海洋芋螺，亦被称作芋螺多肽。在全球范围内，芋螺的种类多达500余种，每种芋螺能够生成上千种活性多肽，而且不同芋螺所产生的活性多肽存在差异，由此推测芋螺多肽的种类或许高达上百万种，这无疑是一个极具研究价值的生物多肽库。依据芋螺多肽所作用的受体以及生理活性，可将其划分为若干亚家族，通常在芋螺毒素名称前用希腊字母加破折号来表示，主要包括α-、μ-、ψ-、ω-、σ-、γ-、δ-等等。大多数芋螺毒素富含二硫键，拥有特定的分子结构，能够有选择性地作用于细胞膜上特定的离子通道或受体等，从而展现出多种生物学效应。20世纪80年代，olivera等人率先从芋螺中成功分离出芋螺毒素。由于其具备功能独特、副作用小、靶向明确等优点，遂成为药理学、生物医学等领域的关注重点。此外，神奇的芋螺还激发了祛皱淡纹的灵感，2012年，瑞士科学家研发出了芋螺肽，在护肤医美领域开启了“祛皱魔法之门”。
3、μ-芋螺毒素是近些年来颇为热门的即时祛皱多肽。与蜘蛛、蝎、蛇等动物的毒素相比，其肽链明显更短，二硫键丰富，分子结构紧密，生物活性极高。它可特异性地阻断肌肉纤维中na+离子内流的通道nav1.4，使得na+离子内流受阻，肌肉动作电位无法形成，从而令表情肌得以松弛，减少皱
4、μ-芋螺毒素kiiia来源于印度洋-太平洋地区的木下芋螺(conus kinoshitai)，由16个氨基酸组成，为已知最短的μ-芋螺毒素，序列为：
5、c1-c2-n3-c4-s5-s6-k7-w8-c9-r10-d11-h12-s13-r14-c15-c16-nh2，含有三对二硫键，链接方式为：cys1-cys9，cys2-cys15和cys4-cys16。与该家族中的其他μ-芋螺毒素一样，kiiia能抑制nav1.2和nav1.4，并且还能以纳摩尔亲和力选择性作用于外周镇痛靶点nav1.7。作为经典芋螺多肽的进阶版产品，由22个氨基酸缩短至16个氨基酸，穿透力增强，稳定性提高，可以擦除皱纹，实现即时祛皱，1.5ppm时就具有抑制动作电位的产生的效果，通过涂抹即可达到注射肉毒杆菌毒素的作用，有望替代注射等侵入式祛皱方法，从而更安全有效地祛皱，避免侵入式产品对人体造成感染、面瘫等潜在危害，在美容方面具有巨大的应用价值。
6、μ-芋螺毒素kiiia的cas#为884469-67-4，分子式：
7、c70h106n28o22s6，exact mass:1882.636，mw:1884.152，化学结构见图1。当下获取μ-芋螺毒素kiiia主要存有3种方式。首先是直接提取法：直接于野生芋螺的毒管中予以分离获取，不过，此方式的获取量甚为稀少。并且，近些年来鉴于海洋生态遭到破坏，野生芋螺的数量大幅减少，运用这种方法将会进一步使芋螺资源的恶化程度加剧。此外，核废水污染可能致使提取出来的产品存在潜在危害。其次是生物法合成：将芋螺毒素的基因转至大肠杆菌或酵母等微生物中以促使其表达，但是，芋螺毒素的氨基酸序列较短，同时翻译后的修饰繁多，致使后期的分离纯化颇具难度。最后是多肽固相合成法：按照传统的固相合成、氧化思路，合成直链多肽，在氧化环化后选取具备特定二硫键链接方式的多肽展开分离纯化。鉴于kiiia具有三对二硫键，能够组合形成15种异构体，所以分离纯化工作困难重重；通过利用三对cys不同侧链保护基的差异性来达成定位环化，存在步骤繁琐、副反应众多、收率低下、可操作性欠佳等弊端，无法进行规模化生产。如structural and functional insightsinto the inhibition of human voltage-gated sodium channels byμ-conotoxinkiiia disulfide isomers采用传统的固相合成法制备μ-芋螺毒素kiiia，利用三对cys不同侧链保护基的差异化来实现定位环化，步骤繁琐，收率低，产率仅达到10％。
技术实现思路
1、为了解决现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种具有即时祛皱功效的μ-芋螺毒素kiiia的水基合成方法，本专利技术提供的方法具有环境友好性、成本低、收率高等优点。
2、为了实现上述目的，本专利技术的技术方案为：
3、本专利技术的第一个方面，提供一种合成μ-芋螺毒素kiiia的方法，包括：
4、采用固相合成法，以h-rink酰胺chemmatrix树脂为固相合成载体，在乙腈水溶液中按照μ-芋螺毒素kiiia主链c端至n端的氨基酸顺序依次缩合取代基保护的氨基酸残基，得到还原态多肽粗肽；
5、在含有三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、盐酸胍、还原型谷胱甘肽及氧化型谷胱甘肽的水溶液中氧化环化还原态多肽粗肽，得μ-芋螺毒素kiiia。
6、在本专利技术的一些实施例中，所述μ-芋螺毒素kiiia主链c端至n端的氨基酸顺序为：
7、c1-c2-n3-c4-s5-s6-k7-w8-c9-r10-d11-h12-s13-r14-c15-c16-nh2。
8、在本专利技术的一些实施例中，还原态多肽粗肽的制备方法包括：以h-rink酰胺chemmatrix树脂为固相合成载体，依次从c端至n端缩合smoc-l-cys(trt)-oh，smoc-l-cys(trt)-oh，smoc-l-arg(pbf)-oh，smoc-l-ser(tbu)-oh，smoc-l-his(trt)-oh，smoc-l-asp(otbu)-oh，smoc-l-arg(pbf)-oh，smoc-l-cys(trt)-oh，smoc-l-trp(boc)-oh，smoc-l-lys(boc)-oh，smoc-l-ser(tbu)-oh，smoc-l-ser(tbu)-oh，smoc-l-cys(trt)-oh，smoc-l-asn(trt)-oh，smoc-l-cys(trt)-oh，smoc-l-cys(trt)-oh，裂解、干燥后得到还原态多肽粗肽。
9、在本专利技术的一些实施例中，还原态多肽粗肽的制备方法包括：
10、取h-rink酰胺chemmatrix树脂在纯化水中溶胀，并以纯化水进行洗涤；
11、将首个氨基酸smoc-l-cys(trt)-oh和缩合剂加入乙本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种合成μ-芋螺毒素KIIIA的方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述μ-芋螺毒素KIIIA主链C端至N端的氨基酸顺序为：
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还原态多肽粗肽的制备方法包括：以H-RINK酰胺CHEMMATRIX树脂为固相合成载体，依次从C端至N端缩合Smoc-L-Cys(Trt)-OH，Smoc-L-Cys(Trt)-OH，Smoc-L-Arg(Pbf)-OH，Smoc-L-Ser(tBu)-OH，Smoc-L-His(Trt)-OH，Smoc-L-Asp(otBu)-OH，Smoc-L-Arg(Pbf)-OH，Smoc-L-Cys(Trt)-OH，Smoc-L-Trp(Boc)-OH，Smoc-L-Lys(Boc)-OH，Smoc-L-Ser(tBu)-OH，Smoc-L-Ser(tBu)-OH，Smoc-L-Cys(Trt)-OH，Smoc-L-Asn(Trt)-OH，Smoc-L-Cys(Trt)-OH，Smoc-L-Cys(Trt)-OH，裂解、干燥后得到还原态多肽粗肽。
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5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述H-RINK酰胺CHEMMATRIX树脂取代度为0.4-0-6mmol/g；
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，活化过程中，第1-7个氨基酸Smoc-L-Cys(Trt)-OH，Smoc-L-Cys(Trt)-OH，Smoc-L-Asn(Trt)-OH，Smoc-L-Cys(Trt)-OH，Smoc-L-Ser(tBu)-OH，Smoc-L-Ser(tBu)-OH，Smoc-L-Lys(Boc)-OH相对于树脂的摩尔比均2.5-3.0；第8-16个氨基酸Smoc-L-Trp(Boc)-OH，Smoc-L-Cys(Trt)-OH，Smoc-L-Arg(Pbf)-OH，Smoc-L-Asp(otBu)-OH，Smoc-L-His(Trt)-OH，Smoc-L-Ser(tBu)-OH，Smoc-L-Arg(Pbf)-OH，Smoc-L-Cys(Trt)-OH，Smoc-L-Cys(Trt)-OH相对于树脂的摩尔比均为2.0-2.5；
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述缩合剂由1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、2-肟氰乙酸乙酯和碳酸氢钠组成；其中，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、2-肟氰乙酸乙酯和碳酸氢钠相对于树脂的摩尔比为(4～6):(2～4):(2～4)；
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，脱除Smoc保护基的试剂为氢氧化钠和乙醇胺的混合溶液；
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，裂解还原态多肽树脂时加入裂解液，所述裂解液为体积分数15～20％的六氟异丙醇二氯甲烷溶液，所述裂解液的用量为还原态多肽树脂体积的9-11倍。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，μ-芋螺毒素KIIIA的制备方法包括：
...【技术特征摘要】
1.一种合成μ-芋螺毒素kiiia的方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述μ-芋螺毒素kiiia主链c端至n端的氨基酸顺序为：
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还原态多肽粗肽的制备方法包括：以h-rink酰胺chemmatrix树脂为固相合成载体，依次从c端至n端缩合smoc-l-cys(trt)-oh，smoc-l-cys(trt)-oh，smoc-l-arg(pbf)-oh，smoc-l-ser(tbu)-oh，smoc-l-his(trt)-oh，smoc-l-asp(otbu)-oh，smoc-l-arg(pbf)-oh，smoc-l-cys(trt)-oh，smoc-l-trp(boc)-oh，smoc-l-lys(boc)-oh，smoc-l-ser(tbu)-oh，smoc-l-ser(tbu)-oh，smoc-l-cys(trt)-oh，smoc-l-asn(trt)-oh，smoc-l-cys(trt)-oh，smoc-l-cys(trt)-oh，裂解、干燥后得到还原态多肽粗肽。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还原态多肽粗肽的制备方法包括：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述h-rink酰胺chemmatrix树脂取代度为0.4-0-6mmol/g；
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，活化过程中，第1-7个氨基酸smoc-l-cys(trt)-oh，smoc-l...
【专利技术属性】
技术研发人员：姬胜利，郭凯，于甜甜，赵仕法，鹿行行，
申请(专利权)人：润辉生物技术威海有限公司，
类型：发明
国别省市：
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