【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物合成领域，具体涉及一种生产糖基供体udp-阿拉伯糖的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用。
技术介绍
1、糖苷类化合物是重要的天然产物，因其显著的生物活性在医药、化妆品、保健品等领域得到了广泛应用。如人参皂苷作为三萜皂苷的一种，因其多种药理活性而备受关注；黄酮类化合物中的多种糖苷形式，也因其抗氧化和抗炎活性而被广泛应用。
2、糖苷类化合物经天然产物苷元经糖基化修饰而来，糖基化作为天然产物的一种重要修饰方式，通过改变其物理化学性质，来提高其生物利用率和药理活性。常见的修饰糖包括d-葡萄糖（glc）、d-半乳糖（gal）、d-葡萄糖醛酸（glca）、l-鼠李糖（rha）、d-木糖（xyl）、d-芹菜糖和l-阿拉伯糖（ara）。其中，l-ara是植物细胞壁形成的重要组成部分。在天然产物中，阿拉伯糖基化修饰相对较少见，但作为关键的小分子糖基化单元，其在调节天然产物活性中起着独特的作用。然而，实现阿拉伯糖基化修饰的一个主要挑战在于其糖供体——udp-β-l-阿拉伯糖（udp-ara）的高昂成本（约90美元/毫克）。这一高成本主要归因于其复杂的化学合成步骤和低产率，极大地限制了其在大规模糖苷类化合物生产中的应用。
3、利用微生物如大肠杆菌和酵母作为异源宿主，引入和表达源于植物天然产物合成途径，是一种稳健且可持续的替代方案。酿酒酵母具有遗传背景明确、遗传操作性强、发酵性能优越等优点，成为构建异源代谢途径的理想宿主。与原核宿主如大肠杆菌不同，酵母细胞含有内质网，是参与植物糖苷类天然产物生物合成的膜结合酶如c
4、目前尚未见到在酿酒酵母中构建udp-ara合成途径的报道。 udp-ara的合成路径相较于其他udp糖要长且复杂。首先，udp-glc在udp-glc脱氢酶（ugdh）的催化下，转化为udp-glca；随后，udp-glca在udp-glca脱羧酶（uxs）的催化下进一步转化为udp-xyl；最后，udp-xyl在udp-xyl-4-差向异构酶（uxe）或udp-glc-4-差向异构酶（uge）的作用下转化为udp-ara。本专利技术利用合成生物学技术，以酿酒酵母为出发菌株，引入并表达上述关键酶（ugdh、uxs、uxe或uge），构建了完整的udp-ara合成途径，首次实现udp-ara在酵母中的生物合成，并成功制备了阿拉伯糖基化的齐墩果酸和白桦脂酸，在阿拉伯糖基化的糖苷类化合物的工业化生产方面具有重要的研究价值和广阔的应用前景。
技术实现思路
1、为了解决阿拉伯糖基化的复杂糖苷类化合物在酵母中的发酵生产，本专利技术提供一种生产糖基供体udp-阿拉伯糖的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用。
2、本专利技术提供一种生产udp-ara的酿酒酵母工程菌，其特征在于所述酿酒酵母工程菌通过在酿酒酵母株系wat11上依次表达udp-glc脱氢酶（ugdh）、udp-glca脱羧酶（uxs）、udp-xyl-4-差向异构酶（uxe）或udp-glc-4-差向异构酶（uge）的方法构建；所述ugdh选自atugdh3，所述uxs选自atuxs3或guuxs2，所述uxe选自guuxe1，所述uge选自psuge2；
3、所述atugdh3的dna序列为seq id no:1，其包含seq id no:2的氨基酸序列；
4、所述atuxs3的dna序列为seq id no:3，其包含seq id no:4的氨基酸序列；
5、所述guuxs2的dna序列为seq id no:5，其包含seq id no:6的氨基酸序列；
6、所述psuge2的dna序列为seq id no:7，其包含seq id no:8的氨基酸序列；
7、所述guuxe1的dna序列为 seq id no:9, 其包含seq id no:10的氨基酸序列。
8、本专利技术的另一实施方案提供上述生产udp-ara的酿酒酵母工程菌，其特征在于所述uxs选自atuxs3，所述uge选自psuge2；或者所述uxs选自guuxs2，所述uxe选自guuxe1。
9、本专利技术的另一实施方案提供上述生产udp-ara的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤：
10、（1）在酿酒酵母株系wat11中表达atugdh3构建udp-glca的合成途径，形成wa1菌株；
11、（2）在wa1菌株中表达atuxs3构建udp-xyl的合成途径；继续表达psuge2构建udp-ara的合成途径，形成wa2菌株，即为所述生产udp-ara的酿酒酵母工程菌；
12、或者（3）在wa1菌株中表达guuxs2构建udp-xyl的合成途径；继续表达guuxe1构建udp-ara的合成途径，形成wa3菌株，即为所述生产udp-ara的酿酒酵母工程菌。
13、通过采用上述技术方案，设计udp-ara的合成途径，构建生产udp-ara的酿酒酵母工程菌，即在酿酒酵母工程菌中构建udp-ara的合成路线，并可同时得到udp-ara合成途径上的三种糖供体udp-glca、udp-xyl和udp-ara，通过进一步的放大优化后，有望促进阿拉伯糖基化的糖苷类化合物的酵母工业化生产。
14、本专利技术的另一方面提供上述生产udp-ara的酿酒酵母工程菌（wa2和/或wa3）在制备ara-齐墩果酸中的应用。该应用优选包括如下步骤：
15、（1）在上述两株生产udp-ara的酿酒酵母工程菌wa2和/或wa3依次表达鲨烯环氧酶（erg1）、鲨烯合酶（erg9）、β-香树脂醇合酶（cqbas1）、氧化酶（cqcyp716a78），完成齐墩果酸从头合成途径的构建，形成菌株wa6和/或wa7。
16、所述erg1的dna序列为 seq id no:11，其包含seq id no:12的氨基酸序列；
17、所述erg9的dna序列为 seq id no:13，其包含seq id no:14的氨基酸序列；
18、所述cqbas1的dna序列为 seq id no:15，其包含seq id no:16的氨基酸序列；
19、所述cqcyp716a78的dna序列为 seq id no:17, 其包含seq id no:18的氨基酸序列。
20、（2）在菌株wa6和/或wa7中引入阿拉伯糖转移酶基因ugt99d1，完成ara-齐墩果酸从头合成途径的构建，形成菌株wa8和/或wa9；
21、所述ugt99d1的dna序列为 seq id no:19, 其包含seq id no:20的氨基酸序列。
22、本专利技术的另一实本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种生产UDP-Ara的酿酒酵母工程菌，其特征在于所述酿酒酵母工程菌通过在酿酒酵母株系WAT11上依次表达UDP-Glc脱氢酶、UDP-GlcA脱羧酶、UDP-Xyl-4-差向异构酶或UDP-Glc-4-差向异构酶的方法构建；所述UDP-Glc脱氢酶选自AtUGDH3，所述UDP-GlcA脱羧酶选自AtUXS3或GuUXS2，所述UDP-Xyl-4-差向异构酶选自GuUXE1，所述UDP-Glc-4-差向异构酶选自PsUGE2；
2.权利要求1所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于所述UDP-GlcA脱羧酶选自AtUXS3，所述UDP-Glc-4-差向异构酶选自PsUGE2；或者所述UDP-GlcA脱羧酶选自GuUXS2，所述UDP-Xyl-4-差向异构酶选自GuUXE1。
3.权利要求1-2任一项所述的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤：
4.权利要求1-2任一项所述的酿酒酵母工程菌在制备Ara-齐墩果酸中的应用。
5.权利要求4所述的应用，其特征在于包括如下步骤：
6.一种生产Ara-齐墩果酸的酿酒酵母工
7.权利要求1-2任一项所述的酿酒酵母工程菌在制备Ara-白桦脂酸中的应用。
8.权利要求7所述的应用，其特征在于包括如下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种生产udp-ara的酿酒酵母工程菌，其特征在于所述酿酒酵母工程菌通过在酿酒酵母株系wat11上依次表达udp-glc脱氢酶、udp-glca脱羧酶、udp-xyl-4-差向异构酶或udp-glc-4-差向异构酶的方法构建；所述udp-glc脱氢酶选自atugdh3，所述udp-glca脱羧酶选自atuxs3或guuxs2，所述udp-xyl-4-差向异构酶选自guuxe1，所述udp-glc-4-差向异构酶选自psuge2；
2.权利要求1所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于所述udp-glca脱羧酶选自atuxs3，所述udp-glc-4-差向异构酶选自psuge2；或者所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：乔亚南，郝林，刘景颜，李法辉，宋伟国，
申请(专利权)人：山东第二医科大学，
类型：发明
国别省市：
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