【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及识别方法，尤其涉及冰川潜在风险微生物识别方法。
技术介绍
1、现微生物识别方法主要依赖于经典的微生物学和分子生物学技术，包括显微镜观察、微生物培养与分离等技术，这些方法在微生物分类、鉴定和风险评估中发挥了重要作用。
2、现部分识别方法主要依赖于微生物的培养和分离，但许多冰川微生物是难培养或不可培养的，因此传统方法无法全面反映冰川微生物的多样性，即使在可培养的微生物范围内，传统方法也可能因为技术限制而忽略某些重要的微生物种类或亚型，传统的形态学观察和生理生化特征鉴定虽然直观且快速，但分辨率较低，难以区分形态相似或遗传背景相近的微生物种类，而微生物的培养和分离需要较长时间，且需要复杂的实验操作和严格的无菌条件，需要耗费大量的人力和物力资源。
3、因此，针对上述识别方法主要依赖于微生物的培养和分离，但许多冰川微生物是难培养或不可培养的，传统的形态学观察和生理生化特征鉴定虽然直观且快速，但分辨率较低，难以区分形态相似或遗传背景相近的微生物种类，同时微生物的培养和分离需要较长时间的问题，可以设计具有更高的识别效率、准确性和分辨率的冰川潜在风险微生物识别方法，能够更好地满足冰川微生物风险评估的需求。
技术实现思路
1、为了克服现微生物识别方法存在的主要依赖于微生物的培养和分离，但许多冰川微生物是难培养或不可培养的，而传统的形态学观察和生理生化特征鉴定虽然直观且快速，但分辨率较低，同时微生物的培养和分离需要较长时间的问题。
2、本专利技术的技术方
3、s11：args的识别方法
4、使用args-oapv2.0在线分析工具快速鉴定args并定量分析基因丰度，网页地址：https://github.com/xiaole99/args-oap-v2.0，分析流程如下；
5、s111；通过ublast从clean reads中预筛选潜在的arg序列；
6、s112；使用ublast对序列进行注释；
7、s113；根据注释结果获得每个样品中arg类型和亚类型的归一化丰度，单位为ppm；
8、s114；使用args-oap v2.0，网页地址：
9、http://bacmet.biomedicine.gu.se/，参考bacmet数据库对args类型和亚类型进行注释和定量化(mao et al.,2023)；
10、s115；args丰度参考16s rrna根据下面公式计算得到(yin et al.,2018)；
11、
12、其中，n16s sequence参考数据库的映射读数；narg―like sequence参考序列长度；lreads读长；n16s sequence16 s rrna clean reads数量；l16s sequence16srrna平均读长；
13、通过arg-oap v2.0分配给16s rrna的读数；
14、s12：宏基因组分析方法
15、利用megahit(v1.1.3)(li et al.,2016)软件对单个样品进行组装以及对相同地点相同采样时间的样品进行混合组装获得contigs，联合metabat2(kang et al.,2019)、maxbin 2(wu et al.,2016)和concoct(alneberg et al.,2014)计算contigs之间的相关性，进行聚类、分箱，得到metagenome assembled genomes(mags)；利用drep(olm et al.,2017)识别样品中高度相似的mags组，获得非冗余mags集；
16、样品中mags的丰度根据下面公式计算得到：
17、
18、其中，reads mapping percentage是指样品中与非冗余mags集比对上的reads的数占该样品总reads数的百分比，mag coverage是指mag在该样品的覆盖度，total magcoverage是指所有mags在该样品中的覆盖度之和；
19、基于宏基因组组装方法对args的冰川宿主——耐药菌进行识别，识别步骤如下；
20、s121：首先对测序数据进行质控，采用生物信息分析软件对序列进行组装和基因预测，将预测基因与ncbi nr数据库，功能基因数据库kegg和args数据库card，致病基因phi-base数据库，转座子isfinder数据库进行序列比对与功能注释；
21、s122：构建冰川微生物组装基因组，即mags集，筛选出冰川样品中含args的微生物组装基因组，即耐药菌，并合并统计携带相同args类型的耐药菌的丰度，进而比较冰川生境中耐药菌的空间分布格局；
22、s13：vfs识别方法
23、识别步骤如下：
24、s1311：利用bbmap(v38.43)软件的bbwrap.sh脚本在slow模式下与vfs数据库(virulence factors database,vfdb)(chen et al.,2005)中核心vfs序列，即核酸序列vfdb_seta_nt.fas，蛋白序列vfdb_seta_pro.fas进行比对，识别和比对相应的vfs；
25、s1312：使用带有默认参数的内部脚本pile.sh估计每个样本中参考序列的覆盖率；
26、vfs分类的步骤如下；
27、s1321：使用工具gtdb-tk(v0.3.2)基于vfdb分类数据库对mags携带的vfs进行分类；
28、s1322：根据vfdb数据库中分类标准与vfs的功能，分为进攻型、运动型、防御型、免疫型、毒性蛋白和未知型；
29、s14：致病耐药菌的识别方法
30、args和vfs被认为是与健康风险有关的微生物标记基因，args和vfs共存风险识别步骤如下：
31、s141：首先预测每个mag的所有contigs中的开放阅读框，即orf；
32、s142：为了识别潜在的属于args的orf，利用blastp将orf与args数据库比对，筛选条件：similarity>80％,the length of its top hit in the database>70％，提取出所有被认为是潜在的args序列的orfs；
33、s143：使用相同的方法，利用blastp将orf与vfdb蛋白序列vfdb_seta_pro.fas比对，识别出所有被认为是潜在的vfs序列的orfs；
34、s144：既含有args序列，又含有vfs序列的mags即被认为是args-vfs配对mags；
35、s145：计算每个样品中所有args-vfs配对mags的丰度，并进行了mags的物种注释；...
【技术保护点】
1.冰川潜在风险微生物识别方法，其特征在于，其方法步骤如下；
2.根据权利要求1所述的冰川潜在风险微生物识别方法，其特征在于：S112中参数为：>75bp alignlength,>80％identity and e-value<10-7。
3.根据权利要求1所述的冰川潜在风险微生物识别方法，其特征在于：S12中利用MetaWRAP pipeline中的bin_refinement模块(Uritskiy et al.,2018)依据完整性>50％、污染率<10％筛选MAGs。
4.根据权利要求1所述的冰川潜在风险微生物识别方法，其特征在于：S121中NCBInr数据库网页地址为：https://www.ncbi.nlm.nih.gov，功能基因数据库KEGG网页地址为：http://www.genome.jp/kegg/，ARGs数据库CARD网页地址为：http://arpcard.mcmaster.ca/？q＝CARD/ontology/35506，致病基因PHI-base数据库网页地址为：http://www
5.根据权利要求1所述的冰川潜在风险微生物识别方法，其特征在于：S1311中核心VFs序列的下载地址为：
6.根据权利要求1所述的冰川潜在风险微生物识别方法，其特征在于：S1321中用于VFs分类的VFDB数据库来源于：http://www.mgc.ac.cn/cgi-bin/VFs/v5/main.cgi。
7.根据权利要求1所述的冰川潜在风险微生物识别方法，其特征在于：S1322中进攻型、运动型、防御型、免疫型、毒性蛋白和未知型的主要功能如下；
8.根据权利要求1所述的冰川潜在风险微生物识别方法，其特征在于：S15中选择pathfact pipeline(v.1.0)是因为与其他类似工具相比，它的性能更好。
...【技术特征摘要】
1.冰川潜在风险微生物识别方法，其特征在于，其方法步骤如下；
2.根据权利要求1所述的冰川潜在风险微生物识别方法，其特征在于：s112中参数为：>75bp alignlength,>80％identity and e-value<10-7。
3.根据权利要求1所述的冰川潜在风险微生物识别方法，其特征在于：s12中利用metawrap pipeline中的bin_refinement模块(uritskiy et al.,2018)依据完整性>50％、污染率<10％筛选mags。
4.根据权利要求1所述的冰川潜在风险微生物识别方法，其特征在于：s121中ncbinr数据库网页地址为：https://www.ncbi.nlm.nih.gov，功能基因数据库kegg网页地址为：http://www.genome.jp/kegg/，args数据库card网页地址为：http://arpcard.mcmaster.ca/？q＝c...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘勇勤，毛冠男，
申请(专利权)人：中国科学院青藏高原研究所，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。