【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于检测荧光的方法。本申请基于分别在2022年6月20日在日本申请的日本特愿2022-099031号、日本特愿2022-099032号、日本特愿2022-099033号以及日本特愿2022-099035号主张优先权，并将它们的内容援引至此。
技术介绍
1、作为微量的分析对象分子的检测方法，已知有应用fret(fluorescenceresonance energy transfer，荧光共振能量转移)的方法。
2、例如，在基因诊断中，存在很多准确且迅速地检测、定量靶核酸的方法。其中，侵入裂解分析(invasive cleavage assay，ica)是应用了使用5’-核酸酶等核酸裂解酶的侵入反应和fret的方法，操作性和反应稳定性优异(例如非专利文献1)。
3、在此，参照图1对ica进行说明。图1是用于说明ica的一例的示意图。在图1的例子中，检测靶核酸100中的t(胸腺嘧啶)碱基101的存在。首先，使与靶核酸100互补的flap探针110和侵入探针120杂交。其结果，侵入探针120杂交在靶核酸100的与flap探针110所杂交的位置邻接的部位。并且，侵入探针120的3’末端的至少1个碱基侵入到flap探针110与靶核酸100杂交的区域141的5’末端的位置，形成第1三层链结构130。
4、接着，当使flap核酸内切酶与第1三层链结构130反应时，第1三层链结构130的flap部位140被切断，生成核酸片段140。接着，核酸片段140与核酸片段150杂交而形成第2三层链结构16
5、在图1的例子中，核酸片段150的5’末端结合有荧光物质f，在距核酸片段150的5’末端数个碱基的3’侧结合有淬灭物质q。荧光物质f和淬灭物质q在空间上位于附近。因此，荧光物质f发出的荧光可被淬灭物质q淬灭。
6、接着，当使flap核酸内切酶与第2三层链结构160反应时，第2三层链结构160的flap部位170被切断，生成核酸片段170。其结果，荧光物质f从淬灭物质q游离，在激发光的照射下发出荧光。通过检测该荧光，能够检测靶核酸100中的t(胸腺嘧啶)碱基101的存在。
7、在本说明书中，有时将flap探针称为等位基因探针。另外，有时将侵入探针称为侵入寡核苷酸。
8、在非专利文献1中记载的ica中，使用具有荧光物质和淬灭物质的fret盒。在反应体系中不存在靶核酸的情况下，荧光物质位于淬灭物质的空间附近。由此，来自荧光物质的荧光发光被所述淬灭物质抑制。在反应体系中存在靶核酸的情况下，在核酸裂解酶作用下ica反应进行，荧光物质与淬灭物质分离。由此，从荧光物质发出荧光。
9、在ica中，通过使用与多种靶核酸对应的荧光波长不同的多种探针，也能够同时检测多种靶核酸。例如，在荧光为蓝色、绿色、黄色、橙色、红色这5种颜色的情况下，能够在一次测定中同时检测5种不同的靶核酸。
10、另外，在微小孔等微小空间内进行ica的情况下，表观上，能够浓缩反应体系中的分析对象分子的浓度。由此，在微小空间中，能够缩短检测信号达到充分的强度为止的时间。例如，专利文献1中记载了通过在1pl以下的容积的微小空间内进行酶反应，能够进行基因检查。
11、现有技术文献
12、专利文献
13、专利文献1：日本特开2004-309405号公报
14、非专利文献
15、非专利文献1：eis et al,an invasive cleavage assay for directquantitation of specific rnas,nature biotechnology,vol.19,673-676(2001).
技术实现思路
1、专利技术所要解决的课题
2、本专利技术的目的在于提供一种在微量的分析对象分子的检测反应中改善反应效率的技术。
3、例如，在使用多种荧光探针的情况下，基于荧光分子的特性，蓝色和红色的荧光强度弱，因此难以检测到荧光。因此，在一个方式中，本专利技术提供一种在分析对象分子的存在下进一步提高从具有荧光物质和淬灭物质的荧光探针发出的荧光强度的检测方法。
4、另外，专利技术者们发现，在ica中，图1所示的由核酸片段140和核酸片段150(以下有时称为“荧光底物”)的杂交形成的三层链结构的形成会受到标记在荧光底物上的荧光物质f和淬灭物质q的阻碍。如果三层链结构的形成受到阻碍，则ica的反应性降低。因此，在一个方式中，本专利技术提供一种能够高效地形成三层链结构的ica用的荧光底物。
5、另外，专利技术者们发现，在如图1所例示的ica中，除了基因多态性或基因突变特异性的信号以外，有时背景的信号也上升。背景信号的上升与假阳性判定有关，可以说是导致基因诊断中的误判的危险因素。因此，在一个方式中，本专利技术提供一种抑制ica中的背景上升的技术。
6、另外，专利技术者们发现，在如图1所例示的ica中，利用flap核酸内切酶进行的荧光底物的切断效率有改良的余地。因此，在一个方式中，本专利技术提供一种在ica中提高利用flap核酸内切酶进行的荧光底物的切断效率的技术。
7、用于解决课题的手段
8、本专利技术包含以下的方式。
9、[1]一种用荧光物质和淬灭物质标记的单链寡核苷酸，其为下述单链寡核苷酸：通过自杂交在5’侧形成发夹结构，当具有与3’侧互补的碱基序列的单链寡核苷酸杂交时，在5’末端部分形成三层链结构，通过被识别出所述三层链结构的flap核酸内切酶切断，所述荧光物质与所述淬灭物质游离，在激发光的照射下发出荧光；其中，所述单链寡核苷酸满足以下的(a)～(c)中的任一个：
10、(a)在所述发夹结构的内部包含不互补的碱基对的单链寡核苷酸；
11、(b)标记有所述荧光物质的核苷酸残基与标记有所述淬灭物质的核苷酸残基分隔4个残基以上的单链寡核苷酸；
12、(c)所述荧光物质结合在除碱基以外的部分的单链寡核苷酸。
13、[2]根据[1]所述的单链寡核苷酸，其中，满足所述(a)，所述荧光物质标记在5’末端的核苷酸残基上，所述淬灭物质标记在构成所述不互补的碱基对的核苷酸残基中的更位于5’侧的核苷酸残基上。
14、[3]根据[1]所述的单链寡核苷酸，其中，5’末端的核苷酸残基的碱基为嘧啶碱基。
15、[4]根据[1]所述的单链寡核苷酸，其中，所述淬灭物质标记在比所述荧光物质更靠3’侧的位置上，在被flap核酸内切酶切断的情况下，包含所述荧光物质的寡核苷酸片段游离。
16、[5]根据[1]所述的单链寡核苷酸，其中，所述荧光物质标记在5’末端的核苷酸残基上，在被flap核酸内切酶切断的情况下，包含所述荧光物质的寡核苷酸片段游离，所述寡核苷酸片段的长度为2个残基以上。
17、[6]根据[1]所述的单链寡核苷酸，其中，在5’末端加成有磷酸基且所述荧光物质结合在所述磷酸基本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用荧光物质和淬灭物质标记的单链寡核苷酸，其为下述单链寡核苷酸：通过自杂交在5’侧形成发夹结构，当具有与3’侧互补的碱基序列的单链寡核苷酸杂交时，在5’末端部分形成三层链结构，通过被识别出所述三层链结构的flap核酸内切酶切断，所述荧光物质与所述淬灭物质游离，在激发光的照射下发出荧光；
2.根据权利要求1所述的单链寡核苷酸，其中，满足所述(A)，所述荧光物质标记在5’末端的核苷酸残基上，所述淬灭物质标记在构成所述不互补的碱基对的核苷酸残基中的更位于5’侧的核苷酸残基上。
3.根据权利要求1所述的单链寡核苷酸，其中，5’末端的核苷酸残基的碱基为嘧啶碱基。
4.根据权利要求1所述的单链寡核苷酸，其中，所述淬灭物质标记在比所述荧光物质更靠3’侧的位置上，在被flap核酸内切酶切断的情况下，包含所述荧光物质的寡核苷酸片段游离。
5.根据权利要求1所述的单链寡核苷酸，其中，所述荧光物质标记在5’末端的核苷酸残基上，在被flap核酸内切酶切断的情况下，包含所述荧光物质的寡核苷酸片段游离，所述寡核苷酸片段的长度为2个残基以上。
7.根据权利要求1所述的单链寡核苷酸，其中，所述淬灭物质结合在比所述荧光物质更位于3’侧的核苷酸残基的碱基上。
8.根据权利要求1所述的单链寡核苷酸，其中，所述荧光物质的分子量为350～1100。
9.根据权利要求1所述的单链寡核苷酸，其中，在所述发夹结构的双链寡核苷酸部分的一个链上存在所述荧光物质和所述淬灭物质这两者。
10.一种用于从具有荧光物质、淬灭物质和基体主体的基体检测荧光的方法，
11.根据权利要求10所述的方法，其中，使所述荧光物质发出荧光的工序在靶物质的存在下进行。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中，所述淬灭物质的吸收光谱的峰值波长比所述荧光物质的发光光谱的峰值波长短50～100nm。
13.根据权利要求10或11所述的方法，其中，所述基体主体为核酸。
14.根据权利要求10或11所述的方法，其中，所述荧光物质的发光光谱的峰值波长为600～700nm，所述淬灭物质的吸收光谱的峰值波长为550～640nm。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，在使所述荧光物质发出荧光的工序中，在核酸裂解酶的作用下，所述基体中的所述荧光物质与所述淬灭物质分离。
16.根据权利要求10或11所述的方法，其中，使所述荧光物质发出荧光的工序在微小空间内进行。
17.根据权利要求11所述的方法，其中，所述靶物质为核酸。
18.根据权利要求10或11所述的方法，其中，进一步用荧光显微镜观察所述荧光。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种用荧光物质和淬灭物质标记的单链寡核苷酸，其为下述单链寡核苷酸：通过自杂交在5’侧形成发夹结构，当具有与3’侧互补的碱基序列的单链寡核苷酸杂交时，在5’末端部分形成三层链结构，通过被识别出所述三层链结构的flap核酸内切酶切断，所述荧光物质与所述淬灭物质游离，在激发光的照射下发出荧光；
2.根据权利要求1所述的单链寡核苷酸，其中，满足所述(a)，所述荧光物质标记在5’末端的核苷酸残基上，所述淬灭物质标记在构成所述不互补的碱基对的核苷酸残基中的更位于5’侧的核苷酸残基上。
3.根据权利要求1所述的单链寡核苷酸，其中，5’末端的核苷酸残基的碱基为嘧啶碱基。
4.根据权利要求1所述的单链寡核苷酸，其中，所述淬灭物质标记在比所述荧光物质更靠3’侧的位置上，在被flap核酸内切酶切断的情况下，包含所述荧光物质的寡核苷酸片段游离。
5.根据权利要求1所述的单链寡核苷酸，其中，所述荧光物质标记在5’末端的核苷酸残基上，在被flap核酸内切酶切断的情况下，包含所述荧光物质的寡核苷酸片段游离，所述寡核苷酸片段的长度为2个残基以上。
6.根据权利要求1所述的单链寡核苷酸，其中，在5’末端加成有磷酸基且所述荧光物质结合在所述磷酸基上。
7.根据权利要求1所述的单链寡核苷酸，其中，所述淬灭物质结合在比所述荧光物质更位于3’侧的核苷酸残基的碱基上。
【专利技术属性】
技术研发人员：荻野雅之，长原美咲，牧野洋一，窟内阳介，铃木雄太，
申请(专利权)人：凸版控股株式会社，
类型：发明
国别省市：
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