【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生态学，具体涉及一种基于牙本质87sr/86sr比值精准识别长江江豚与东亚江豚的方法。
技术介绍
1、江豚(neophocaena)是一种小型齿鲸，栖息于东至日本温带海域，西至波斯湾热带海域的近岸水域和一些江河中。关于其分类地位和命名一直具有较大的争议，基于形态学和遗传学特征的研究认为江豚属的分类包括印太江豚(neophocaena phocaenoides)和窄脊江豚(n.asiaeorientalis)两个物种，后者又包含两个亚种(东亚江豚n.a.sunameri和长江江豚n.a.asiaeorientalis)。近些年来，基于长江江豚全基因组测序和种群基因组学的分析认为长江江豚与东亚江豚具有显著而稳定的遗传分化，且遗传分化已达到种间水平。
2、长江江豚是中国特有的淡水鲸类，栖息于中国长江中下游及两大通江湖泊(洞庭湖、鄱阳湖)，自从白鱀豚(lipotes vexillifer)被宣布功能性灭绝以来，长江江豚成为目前长江淡水生态系统中唯一的鲸类。近几十年来，长江江豚种群数量明显减少，据估计，长江江豚的数量在2006年已降至约1800头，而至2012年仅剩1040头，最新考察结果显示长江江豚的自然种群数量实现多年来首次止跌回升(2022年)，也仅为约1249头。东亚江豚栖息于中国台湾海峡、东海和黄海/渤海，韩国西部、南部和东南部沿海以及日本近海地区。该物种栖息于近岸和浅水区，包括海湾、红树林沼泽和河口，因此极易受到航运、渔业、岸线工程等人类活动的影响。目前，长江江豚和东亚江豚分别被国际自然保护联盟(iu
3、长江口位于长江、东海和黄海的交汇处，具有极丰富的饵料生物资源，是中国江豚的热点区域之一，东亚江豚和长江江豚在这里的分布区域接近。同时河口区域受潮汐、盐度变化等因素的影响大，因此，长江江豚和东亚江豚在长江口的分布范围可能存在空间上的重叠。近年来，随着保护工作的深入开展，长江口死亡江豚得到了及时的发现和报告，准确识别死亡个体为长江江豚或东亚江豚成为保护管理和科学研究的前提条件。长江江豚和东亚江豚栖息生境存在显著差异，但在长江口咸淡水交汇区域其分布的边界并不清晰，加之死亡江豚可能顺水漂流，在该水域发现的死亡江豚其物种识别存在难点。长江江豚和东亚江豚的形态相似，目前主要依靠背脊高度、疣粒区宽度和疣粒列数等形态差异加以区分，然而由于长江江豚和东亚江豚均为国家重点保护野生动物，能够收集到用于建立形态学区分参数的样本数量很少，且上述形态特征受到个体生长发育阶段的影响，因此形态区分缺乏成熟的标准，其识别结果较强的主观性；同时，死亡江豚被发现时通常会存在不同程度的腐烂，会严重影响体表形态识别。另外，尽管目前重测序等高通量分子测序技术表明东亚江豚和长江江豚具有显著的遗传分化，但目前缺乏能够精准且低成本区分两者的分子标记。
4、牙齿在许多海洋和陆地哺乳动物的年龄、生境重建、食性转变研究等方面具有重要的价值。牙齿组织高度矿化，牙本质是构成牙齿的主体，其上覆盖着牙釉质，牙齿的血管髓质则被牙本质包围在内。牙本质质量的约72％是由无机矿物质成分(主要是羟基磷灰石)构成的，10％为水，而各种有机成分占牙本质量的约20％。牙本质在动物胎儿时期开始形成，之后逐渐向牙髓腔方向生长，在其积累的过程中反映了个体生长速率的变化，从而形成可以辨别的生长层组(即年轮)。在生长过程中，牙本质记录了其经历的生境的元素和同位素等信息，并且由于高度矿化组织的代谢惰性，牙齿中的微量元素、同位素一旦沉积就不会发生改变，因此牙齿可以记录其一生中生境的元素、同位素信息。目前已有研究探索使用牙齿元素区分主要生活在淡水的长江江豚和主要生活在海洋的东亚江豚。
5、然而，由于元素沉积到牙本质中经过多重生物膜屏障，因此，牙本质元素含量最终与环境中元素含量的关系难以量化，尚无法建立江豚生活在淡水或海水栖息地时对应的元素含量标准。并且，已有研究表明动物的生长发育过程中的生理因素也会导致哺乳动物牙齿中的sr、zn等元素含量的变化，这使得根据元素变化推断生境变化的解读受到极大干扰，导致使用牙齿元素含量研究动物生境转换的客观性受到限制。因此，亟待开发精准鉴别长江江豚和东亚江豚的方法。
技术实现思路
1、解决的技术问题：针对上述技术问题，本专利技术提供一种基于牙本质87sr/86sr比值精准识别长江江豚与东亚江豚的方法，与sr元素含量不同，在生物材料的形成过程中，sr同位素(87sr/86sr)几乎不发生分馏，也不受其生长发育等生理因素的影响，直接反映了其来源的87sr/86sr，因此牙本质87sr/86sr可以代表动物经历的生境中87sr/86sr的直接和完整记录。并且，海洋和淡水等不同的栖息地具有87sr/86sr比值的显著差异，海洋中的87sr/86sr比值较为均一，海洋的87sr/86sr比值约为0.7092，而在中国长江中下游干流，87sr/86sr比值为0.7100-0.7110之间。87sr/86sr比值主要受流域地质因素影响，在不同年份间保持稳定。综上所述，可以根据牙本质的87sr/86sr比值判别江豚个体的栖息生境，87sr/86sr比值为0.7092对应海洋生境生活史，87sr/86sr比值为0.7100-0.7110对应长江淡水生活史，从而据此判别其为长江江豚或是东亚江豚。
2、技术方案：一种基于牙本质87sr/86sr比值精准识别长江江豚与东亚江豚的方法，包括以下步骤：
3、步骤1)采集江豚牙齿样本：采集野外死亡江豚的下颌左侧中间较直的牙齿，如果个体腐烂严重，则尽可能取临近位置的牙齿，如果牙齿缺失过多，则尽量选择磨损不严重的牙齿；
4、步骤2)牙齿前处理：将牙齿拔下，浸泡在胰蛋白酶溶液中24h之后，使用超声波震荡胰蛋白溶液中的牙齿，将牙齿表面和牙髓腔中附着的软组织去除，之后使用去离子水反复震荡清洗牙齿外表面和牙髓腔内部；使用冷镶嵌树脂将清洗烘干后的牙齿包埋，使用小型切割机的金刚石锯片沿牙齿冠状面最长轴切割，将牙齿切成两部分；使用砂纸精细研磨切开的部分冠状面，然后使用抛光布和二氧化硅悬浮液抛光；抛光后使用去离子水清洗牙齿切片并烘干；
5、步骤3)牙本质87sr/86sr比值分析：使用激光剥蚀连接多接收电感耦合等离子体质谱仪从牙尖到牙髓腔对牙本质进行线扫描分析，以获得牙本质的87sr/86sr比值；
6、步骤4)牙齿生长层组测量：使用生物偏光显微镜拍摄牙齿图像，分辨牙本质的生长层组，使用图像测量软件沿87sr/86sr比值分析的激光扫描线测量生长层组宽度，将87sr/86sr比值变化与生长时间联系起来；
7、步骤5)重建87sr/86sr比值变化：分析牙本质从牙釉质界面到牙髓腔的87sr/86sr比值，分析牙本质87sr/86sr比值的变化以及变化发生的位置；将划分出的不同的牙本质87sr/86sr比值变化阶段的平本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于牙本质87Sr/86Sr比值精准识别长江江豚与东亚江豚的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2. 根据权利要求1所述的一种基于牙本质87Sr/86Sr比值精准识别长江江豚与东亚江豚的方法，其特征在于：步骤3）中，使用激光剥蚀连接多接收电感耦合等离子体质谱仪进行牙本质87Sr/86Sr比值分析，分析采用中分辨模式进行。激光剥蚀连接多接收电感耦合等离子体质谱实验中激光能量密度为6.5 J/cm2，剥蚀的斑束直径为64 μm，频率为10 Hz，剥蚀速度为5 μm/s。每次进行激光烧蚀前，测量每种同位素的背景强度，测量200个循环，取平均值用于样品分析时的空白背景校正。通过在每次分析开始和结束时以及分析期间每隔30分钟测量磷灰石标样和现代海洋鲨鱼牙齿的87Sr/86Sr比值来评估江豚牙齿样品87Sr/86Sr比值的准确性和可重复性。
3. 根据权利要求1所述的一种基于牙本质87Sr/86Sr比值精准识别长江江豚与东亚江豚的方法，其特征在于：步骤3）中，通过设置多接收电感耦合等离子体质谱仪的法拉第杯配置，接收m/z 为82、83、83.5、84、85、86
4.根据权利要求1所述的一种基于牙本质87Sr/86Sr比值精准识别长江江豚与东亚江豚的方法，其特征在于：步骤5）中，采用编程统计软件R中的CHANGEPOINT对87Sr/86Sr比值原始检测值数据进行分析，获得个体的87Sr/86Sr比值发生显著变化的点，从而得到87Sr/86Sr比值未有显著变化的平稳阶段，并计算平稳阶段的87Sr/86Sr比值平均值；将平均值分别与长江干流和海洋87Sr/86Sr比值进行对比，判断其形成期间江豚的生境类型，从而根据生境类型推断江豚的物种。
5.根据权利要求1所述的一种基于牙本质87Sr/86Sr比值精准识别长江江豚与东亚江豚的方法，其特征在于：长江干流87Sr/86Sr比值为0.7100-0.7110，海洋87Sr/86Sr比值为0.7092。
...【技术特征摘要】
1.一种基于牙本质87sr/86sr比值精准识别长江江豚与东亚江豚的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2. 根据权利要求1所述的一种基于牙本质87sr/86sr比值精准识别长江江豚与东亚江豚的方法，其特征在于：步骤3）中，使用激光剥蚀连接多接收电感耦合等离子体质谱仪进行牙本质87sr/86sr比值分析，分析采用中分辨模式进行。激光剥蚀连接多接收电感耦合等离子体质谱实验中激光能量密度为6.5 j/cm2，剥蚀的斑束直径为64 μm，频率为10 hz，剥蚀速度为5 μm/s。每次进行激光烧蚀前，测量每种同位素的背景强度，测量200个循环，取平均值用于样品分析时的空白背景校正。通过在每次分析开始和结束时以及分析期间每隔30分钟测量磷灰石标样和现代海洋鲨鱼牙齿的87sr/86sr比值来评估江豚牙齿样品87sr/86sr比值的准确性和可重复性。
3. 根据权利要求1所述的一种基于牙本质87sr/86sr比值精准识别长江江豚与东亚江豚的方法，其特征在于：步骤3）中，通过设置多接收电感耦合等离子体质谱仪的法拉第杯配置，接收m/z 为82、83、83.5、84、85、86、86.5、87和88处信号。在数据分析的过程中，使用“峰值零点”法，通过从每个分析周期中减去空白背景的平均信号来校正kr干扰；接收m/z为82处的信号以监测42ca40ar/42ca40ca峰；通过监测85rb信号根据同位素比计算得出87rb，...
【专利技术属性】
技术研发人员：轩中亚，刘凯，华忠，蔺丹清，应聪萍，尹登花，张家路，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。