【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，涉及一种猪轮状病毒rna疫苗及其制备方法，尤其包括一种猪轮状病毒g9-g4型二价rna疫苗及其制备方法。
技术介绍
1、猪轮状病毒(rotaviruse，rv)为无囊膜的双链rna病毒，属于呼肠孤病毒科(reoviridae)轮状病毒属(rotavirus)。会引起仔猪以呕吐、厌食、脱水、腹泻和酸碱平衡紊乱为主要症状的疾病。小于4周龄仔猪的发病率可以达到80％以上，死亡率达到7-20％。轮状病毒基因编码11种蛋白，分别为内衣壳蛋白(vp1、vp2、vp3和vp6)、外衣壳蛋白(vp7和vp4)和非结构蛋白(nsp1、nsp2、ns34、ns35和ns28)。轮状病毒具有不同的血清群和血清型，根据vp6分为7个血清群(型)(a-g)及两个亚群(ⅰ和ⅱ)，a亚群轮状病毒是引起人类和动物胃肠道疾病的主要病原。依据vp4基因序列差异分为不同的p型，依据vp7基因序列差异分为不同的g型，目前存在27个g型和37个p型，不同型之间的交叉反应性较差。
2、猪轮状病毒感染引起仔猪病毒性腹泻，由此造成仔猪的患病甚至死亡给生猪养殖业造成巨大经济损失。目前没有效果显著的药物用来治疗由猪轮状病毒感染引起的疾病，因此做好对猪轮状病毒感染的预防尤为重要，接种疫苗是有效防控手段。现有疫苗技术存在的问题：
3、(1)目前，国内临床应用最广泛的是猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻与猪轮状病毒(g5型)三联活疫苗(弱毒华毒株+弱毒cv777株病毒+nx株)，该疫苗使用猪轮状病毒g5型。但目前g9型已取代g5成为我国主要流行毒株
4、(2)vp4蛋白包含病毒中和b细胞表位，被认为是研发新型疫苗的主要靶点之一。但正确表达vp4抗原并维持其免疫原性是行业难点。全长vp4蛋白在细胞内表达量较低或者以包涵体形式存在(doi：10.1016/j.vaccine.2018.03.011)。截短vp4可有效改善表达，但一定程度会破坏免疫原性，vp4完整蛋白包含vp5结构域和vp8结构域，如padilla-noriega l等分别表达获得了vp5和vp8蛋白，但是这两个蛋白的免疫原性均明显弱于vp4全长蛋白(doi:10.1128/jcm.30.6.1392-1397)。wen等发现截短的vp8蛋白(aa65-223)可溶表达且产量较高，在豚鼠内诱导产生高滴度中和抗体，但该蛋白在小鼠内诱导的免疫反应却较弱(doi:10.1016/j.vaccine.2012.07.078)；进一步在该蛋白上引入cd4+t细胞表位p2，但其在体内诱导的中和抗体阳性率仍然较低(doi:10.1016/j.vaccine.2014.06.060)。yijianli等构建了截短的vp4蛋白(aa26-476)，该蛋白含有vp8结构域和vp5的stalk结构域，该蛋白以可溶形式表达后可形成稳定的三聚体结构，在小鼠体内可诱导高水平中和抗体并实现对病毒保护，效果明显优于单独的vp8结构域、vp5的stalk结构域以及灭活疫苗(doi:10.1016/j.vaccine.2018.03.011)；但进一步研究显示，该蛋白在本动物猪体内的免疫反应和保护效果均明显弱于现有灭活疫苗技术(doi:10.1128/jvi.00212-24)。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种猪轮状病毒rna疫苗及其制备方法。首先，通过对猪轮状病毒g9型和g4型vp4蛋白及其编码区进行优化，针对优化的vp4蛋白提供优化的环状rna分子，得到p4-6号环状rna和p4-9号环状rna分子，缓解了用现有技术中构建的rna分子活性低、翻译效率差导致的免疫原性低的技术问题。进一步将疫苗载体和上述优化的环状rna混合，得到猪轮状病毒rna疫苗；该方法简单易操作，可实现大规模生产，且有效降低生产成本。本专利技术的包含p4-6号环状rna和/或p4-9号环状rna分子的猪轮状病毒rna疫苗，尤其是猪轮状病毒g9-g4型二价rna疫苗，解决现有商品化疫苗对流行毒株保护不理想的问题，实现对流行毒株交叉保护，且效果优于用现有灭活疫苗技术制备的g9-g4型二价灭活疫苗。
2、为实现上述目的，本专利技术提供的技术方案如下：
3、<第一方面>
4、本专利技术提供一种猪轮状病毒优化的vp4蛋白，所述优化的vp4蛋白为vp4蛋白aa26-776/第225位p突变成a/第226位p突变成a、vp4蛋白aa26-776/第225位p突变成q/第226位p突变成q中的一种。
5、上述vp4蛋白aa26-776/第225位p突变成a/第226位p突变成a指的是vp4蛋白上第225位氨基酸由p突变成a，第226位氨基酸由p突变成a的aa26-776截短序列；vp4蛋白aa26-776/第225位p突变成q/第226位p突变成q指的是vp4蛋白上第225位氨基酸由p突变成q，第226位氨基酸由p突变成q的aa26-776截短序列。
6、作为本专利技术的一个实施方案，所述优化的vp4蛋白的氨基酸序列为seq id no.9、seq id no.10、seq id no.22中的一种。
7、g9型毒株野生型的vp4蛋白全长氨基酸序列为seq id no.4，vp4蛋白aa26-476截短部分的氨基酸序列为seq id no.8，vp4蛋白aa26-776/第225位p突变成a/第226位p突变成a的氨基酸序列为seq id no.9，vp4蛋白aa26-776/第225位p突变成q/第226位p突变成q的氨基酸序列为seq id no.10；
8、g4型毒株野生型的vp4蛋白全长氨基酸序列为seq id no.19，vp4蛋白aa26-776/第225位p突变成q/第226位p突变成q的氨基酸序列为seq id no.22。
9、<第二方面>
10、本专利技术提供一种编码上述任一项所述的vp4蛋白的核苷酸序列，编码优化的vp4蛋白的核苷酸序列为seq id no.13、seq id no.14、seq id no.23中的一种。
11、编码g9型毒株vp4蛋白全长的核苷酸序列如seq id no.3所示，对其进行密码子优化后的序列如seq id no.11所示；编码vp4蛋白aa26-476的核苷酸序列如seq id no.12所示；编码vp4蛋白aa26-776/第225位p突变成a/第226位p突变成a的核苷酸序列如seq idno.13所示，编码vp4蛋白aa26-776/第225位p突变成q/第226位p突变成q的核苷酸序列如seq id no本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种猪轮状病毒优化的VP4蛋白，其特征在于，所述优化的VP4蛋白为VP4蛋白aa26-776/第225位P突变成A/第226位P突变成A、VP4蛋白aa26-776/第225位P突变成Q/第226位P突变成Q中的一种。
2.根据权利要求1所述的优化的VP4蛋白，其特征在于，所述优化的VP4蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.22中的一种。
3.一种编码如权利要求1或2所述的VP4蛋白的核苷酸序列，其特征在于，编码优化的VP4蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.23中的一种。
4.一种如权利要求1或2所述的VP4蛋白序列或如权利要求3所述的核苷酸序列在用于制备重组蛋白质抗原或制备基因工程疫苗中的应用；
5.一种环状RNA分子，其特征在于，制备该环状RNA的载体DNA沿5’向3’的方向依次包括如下元件：内含子片段II、翻译起始元件截断片段II、ORF、插入元件、翻译起始元件截断片段I、内含子片段I；
6.根据权利要求
7.根据权利要求5所述的环状RNA分子，其特征在于，所述内含子片段II的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述插入元件的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述内含子片段I的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
8.根据权利要求5所述的环状RNA分子，其特征在于，所述环状RNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，记为P4-6环状RNA分子；
9.一种组合物，其特征在于，包含如权利要求5-8中任一项所述的环状RNA分子，以及药学上可接受的载体。
10.一种猪轮状病毒G9-G4型二价RNA疫苗，其特征在于，所述G9-G4型二价RNA疫苗是将如权利要求8中所述环状RNA分子中的P4-6环状RNA分子、P4-9环状RNA分子与脂质混合后制备得到的。
11.根据权利要求10所述的G9-G4型二价RNA疫苗，其特征在于，所述G9-G4型二价RNA疫苗是通过包括如下步骤的方法制备而得：
12.根据权利要求11所述的G9-G4型二价RNA疫苗，其特征在于，CMAX4、胆固醇、DSPC、PEG-DMG的摩尔比分别为30％～60％、30％～50％、5％～20％、0.5％～2.0％。
...【技术特征摘要】
1.一种猪轮状病毒优化的vp4蛋白，其特征在于，所述优化的vp4蛋白为vp4蛋白aa26-776/第225位p突变成a/第226位p突变成a、vp4蛋白aa26-776/第225位p突变成q/第226位p突变成q中的一种。
2.根据权利要求1所述的优化的vp4蛋白，其特征在于，所述优化的vp4蛋白的氨基酸序列为seq id no.9、seq id no.10、seq id no.22中的一种。
3.一种编码如权利要求1或2所述的vp4蛋白的核苷酸序列，其特征在于，编码优化的vp4蛋白的核苷酸序列为seq id no.13、seq id no.14、seq id no.23中的一种。
4.一种如权利要求1或2所述的vp4蛋白序列或如权利要求3所述的核苷酸序列在用于制备重组蛋白质抗原或制备基因工程疫苗中的应用；
5.一种环状rna分子，其特征在于，制备该环状rna的载体dna沿5’向3’的方向依次包括如下元件：内含子片段ii、翻译起始元件截断片段ii、orf、插入元件、翻译起始元件截断片段i、内含子片段i；
6.根据权利要求5所述的环状rna分子，其特征在于，所述翻译起始元件截断片段ii的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述翻译起始元件截断片...
【专利技术属性】
技术研发人员：殷波，仲从浩，刘纯西，
申请(专利权)人：上海申锐联生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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