【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物安全，尤其涉及一种基于mira快速检测产don镰刀菌的引物探针组合物、试剂盒及应用。
技术介绍
1、真菌毒素是威胁粮食安全的主要风险因子，其中脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，don)又称呕吐毒素，是小麦污染最为普遍的一种真菌毒素，主要是由禾谷镰刀菌(fusarium.graminearum)、黄色镰刀菌(f.culmorum)等产生的次级代谢产物，具有细胞毒性、致畸和免疫抑制作用，已被世界卫生组织国际癌症研究机构列为3类致癌物。
2、小麦don污染是一个世界性难题。相关研究显示，通过监测小麦不同生长时期携带的产don镰刀菌生物总量将有利于实现don污染风险早期预警。但现有实验室检测方法费时、费力，并且样品运输过程中菌体易产生变化，致使检测结果出现偏差。因此，亟需建立产don镰刀菌现场快速检测方法，及时掌握其污染状况，发现风险并采取高效干预措施，保障小麦产量和质量，同时也为产毒菌污染发生机制及产毒影响因素研究提供数据支撑，有助于精准构建产前小麦don污染预测模型。
3、基于核酸的聚合酶链式反应(polymerase chainreaction pcr,pcr)类型的快速检测技术，例如实时荧光定量pcr(real-time quantitative pcr,qpcr)和数字pcr(digital pcr,dpcr)等，由于具有较高的检测特异性和灵敏度，已被广泛应用于多个检测领域，但该类技术依赖于复杂精密的变温设备，限制了它们在资源匮乏地区以及检测现场等场景下的应用。等温扩增
4、常用的等温扩增技术主要包括链置换扩增(strand displacementamplification,sda)、滚环扩增(rolling circle amplification,rca)、环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,lamp)、重组酶聚合酶扩增(recombinasepolymerase amplification,rpa)、多酶恒温核酸快速扩增(multienzyme isothermalrapidamplification,mira)等技术。其中lamp法由于只需一种酶、扩增效率高，是目前等温扩增技术中应用最多、论文发表量最大的方法，但存在着引物设计复杂、假阳性率偏高、试剂价格高等缺点，并且由于日本知识产权的保护，在我国的转化应用局限性较强。mira依靠多种功能蛋白在常温下协同作用，实现核酸的快速扩增，是能够真正实现便携式的现场快速核酸检测技术，并且其检测试剂为我国拥有自主知识产权，成本相对较低，购买便利，能够保障检测的时效性。此外，现有方法难以实现现场核酸提取和纯化，无法满足全过程现场快速检测需求。
5、mira是近年兴起的一种恒温扩增技术，依靠含有dna聚合酶、单链dna结合蛋白和重组酶的三种核心酶来辅助dna扩增，不需要复杂的温控设备，扩增反应时间短，通过设计特异性引物及带有修饰基团的探针，可以实现荧光检测结果判读。该类检测方法运行的关键在于设计合适的引物和探针，引物的选择会影响检测速度、灵敏度和特异性。
6、因此，找到一种可在现场快速检测产don镰刀菌的方法，对小麦don毒素污染监测预警至关重要。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种基于mira快速检测产don镰刀菌的引物探针组合物、试剂盒及应用，具有操作简单，耗时短，结果自动判读等优点，对田间小麦样本中的产don镰刀菌有较好的检测灵敏度和特异性，能够满足现场快速检测需求。
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
3、本专利技术提供了一种基于mira快速检测产don镰刀菌的引物探针组合物，其特征在于，所述基于mira快速检测产don镰刀菌的引物探针组合物由以下序列组成：
4、正向引物mira-fus-f9，seq id no.9：
5、ctgttgtgcctcgatccatcgctcaggcttgaact；
6、反向引物mira-fus-r4，seq id no.15：
7、cagtccacctatttcatgcacaccgatcccaaga；
8、探针mira-fus-pr1，seq id no.20：
9、gttgtgcctcgatccatcgctcaggcttgaact/fam/spacer/bhq1/cgggctcggggaaa/c3-spacer。
10、进一步的，所述探针mira-fus-pr1序列前部与正向引物序列有部分重叠，探针序列后部与反向引物序列不重叠；所述探针mira-fus-pr1共有4个修饰位点：第34位碱基标记荧光基团，第35位碱基标记四氢呋喃，第36位碱基标记淬灭基团，3'末端修饰封闭基团。
11、本专利技术还提供了一种产don镰刀菌检测试剂盒，其特征在于所述产don镰刀菌检测试剂盒包括权利要求1-2任一项所述基于mira快速检测产don镰刀菌的引物探针组合物。
12、本专利技术还提供了一种产don镰刀菌检测试剂盒在检测产don镰刀菌上的应用。
13、进一步的，所述检测产don镰刀菌的反应体系以25μl计：
14、缓冲溶液14.7μl、10μm正向引物1μl、10μm反向引物1μl、10μm探针0.3μl、冻干酶粉2.5mg、dna或质粒溶液1～5μl、175mm醋酸镁溶液2μl，ddh2o补充体积至25μl。
15、进一步的，所述检测产don镰刀菌的反应温度为42℃，时间为10～30min。
16、本专利技术所述与现有技术相比的有益效果为：
17、(1)本专利技术首次将mira检测技术应用到产don镰刀菌检测，通过比对主要产don镰刀菌—禾谷镰刀菌(f.graminearum)、亚洲镰刀菌(f.asiaticum)、假禾谷镰刀菌(f.pseudograminearum)和黄色镰刀菌(f.culmorum)的tri产毒基因簇，筛选出高度同源序列作为特异性扩增靶标，设计引物探针组合用于实时荧光mira检测，得到检测产don镰刀菌的引物和探针组合物。本申请检测产don镰刀菌的引物和探针组合物的特异性强、灵敏度高。
18、(2)本专利技术使用检测产don镰刀菌的引物和探针组合物检测产don镰刀菌的方法具有操作简单，配套设备便携，耗时短，灵敏度较高，结果自动判读等优点，扩增检测仅需20min左右，可实现现场快速检测，及时发现产don镰刀菌污染风险，提前干预，避免风险发生或扭转损失。
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1.一种基于MIRA快速检测产DON镰刀菌的引物探针组合物，其特征在于，所述基于MIRA快速检测产DON镰刀菌的引物探针组合物由以下序列组成：
2.根据权利要求1所述基于MIRA快速检测产DON镰刀菌的引物探针组合物，其特征在于，所述探针MIRA-Fus-Pr1序列前部与正向引物序列有部分重叠，探针序列后部与反向引物序列不重叠；所述探针MIRA-Fus-Pr1共有4个修饰位点：第34位碱基标记荧光基团，第35位碱基标记四氢呋喃，第36位碱基标记淬灭基团，3'末端修饰封闭基团。
3.一种产DON镰刀菌检测试剂盒，其特征在于所述产DON镰刀菌检测试剂盒包括权利要求1-2任一项所述基于MIRA快速检测产DON镰刀菌的引物探针组合物。
4.一种产DON镰刀菌检测试剂盒在检测产DON镰刀菌上的应用。
5.根据权利要求4所述产DON镰刀菌检测试剂盒在检测产DON镰刀菌上的应用，其特征在于，所述检测产DON镰刀菌的反应体系以25 μL计：
6.根据权利要求4所述产DON镰刀菌检测试剂盒在检测产DON镰刀菌上的应用，其特征在于，所述检测
...【技术特征摘要】
1.一种基于mira快速检测产don镰刀菌的引物探针组合物，其特征在于，所述基于mira快速检测产don镰刀菌的引物探针组合物由以下序列组成：
2.根据权利要求1所述基于mira快速检测产don镰刀菌的引物探针组合物，其特征在于，所述探针mira-fus-pr1序列前部与正向引物序列有部分重叠，探针序列后部与反向引物序列不重叠；所述探针mira-fus-pr1共有4个修饰位点：第34位碱基标记荧光基团，第35位碱基标记四氢呋喃，第36位碱基标记淬灭基团，3'末端修饰封闭基团。
3.一种产don镰刀菌...
【专利技术属性】
技术研发人员：崔华，王松山，陈梦泽，
申请(专利权)人：国家粮食和物资储备局科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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