【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及食品科学，具体涉及一种富含黄酮、dpp-ⅳ抑制肽的协同降糖苦荞粉的制备及新型苦荞源dpp-iv抑制肽。
技术介绍
1、糖尿病的患病率在全球范围内稳步上升，预计2045年将增至7亿，相比于2019年增幅55％，被认为是最严重的慢性疾病之一。其中，二型糖尿病比例占近90％以上，其发病主要与胰岛素抵抗和胰岛β细胞分泌功能减退有关。dpp-iv抑制剂可通过减少glp-1的分解，增加glp-1的浓度从而促进胰岛素分泌，是治疗二型糖尿病的新型有效的治疗方法。现阶段，多种食源性小分子肽已被报道具有dpp-iv抑制活性，如来源于纳豆的kl、lr和大米的ip、lp。其无毒副作用和优异的生物相容性使其在治疗二型糖尿病上具有巨大的应用价值。
2、苦荞，是国际公认的药食同源的谷物，富含蛋白质、膳食纤维以及黄酮类物质，具有调节血糖的功效。苦荞蛋白中含有8种人体必需氨基酸，是少见的优质植物蛋白，可改善胰岛β细胞功能，减轻胰岛素抵抗。然而，苦荞中的致敏蛋白会引起皮肤、消化系统的过敏反应。苦荞蛋白肽是由蛋白酶消化得来，具有比苦荞蛋白更易吸收、更安全、生物活性更高的特点。黄酮作为次级代谢产物，是苦荞发挥降糖活性的主要成分，主要通过苯丙烷代谢途径合成。萌发处理可抑制芦丁降解酶活性，提高黄酮合成关键酶(苯丙氨酸解氨酶，pal)活性，从而有效富集苦荞黄酮；此外，萌发处理还可改善苦荞消化特性，降低或消除抗营养物质的含量。
3、传统的活性肽筛选鉴定方法包括不断分级纯化和质谱鉴定，操作过程复杂且费时。计算机及生物信息学的发展可为鲜味肽的
4、因此，以萌动苦荞作为原料，以虚拟水解结果为导向，采用特定蛋白酶酶解，开发一种富含黄酮、dpp-ⅳ抑制肽的协同降糖苦荞粉的制备方法，最大限度提高苦荞粉中具有降糖活性的黄酮和高活性dpp-iv抑制肽的含量，以期获得富含黄酮含量及高dpp-ⅳ抑制活性肽的苦荞粉，解决现有制备苦荞粉降糖功能不突出的问题，实现1+1＞2的降糖效果，是目前本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
1、为此，本专利技术提供一种富含黄酮、dpp-ⅳ抑制肽的协同降糖苦荞粉的制备方法，以解决现有技术中制备苦荞粉降糖功能不够突出、dpp-ⅳ抑制肽活性肽筛选利用不准确、不迅速的问题。
2、为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
3、根据本专利技术提供的一种富含黄酮、dpp-ⅳ抑制肽的协同降糖苦荞粉的制备方法，包括以下步骤：
4、s1.超声前处理：将苦荞清洗晾干，消毒后进行超声处理；
5、s2.浸麦：将超声前处理过后的苦荞置于25±5℃恒温条件下进行2次间歇浸泡处理；
6、s3.萌芽：恒温恒湿条件下将浸麦后的苦荞进行间歇培养处理，每2-4h喷洒一次3-6％蔗糖溶液，萌发2-4d得到萌芽苦荞；
7、s4.清洗打浆：使用清水将苦荞芽清洗后，按1:10–1:15重量比例加入饮用水进行打浆，并过滤制备得过滤浆；
8、s5.虚拟水解：搜集苦荞蛋白氨基酸序列，通过数据库采用单酶或双酶对序列进行虚拟水解并预测所得肽的dpp-iv抑制活性；
9、s6.体外水解：根据所述s5所得的指导性参数，将所述s4中得到的过滤浆加热，冷却至室温后，调节溶液至蛋白酶最适ph值，按照酶底比添加蛋白酶后水解；
10、s7.序列鉴定：取冷却至室温的酶解液离心后，取上清液进行冷冻干燥，以进行序列鉴定；
11、s8.dpp-iv抑制肽筛选：根据所述s7鉴定结果，采用系列筛选条件对所得肽段进行逐级筛选，以获得特定的高dpp-iv抑制活性肽；
12、s9.干制：对酶解后料液进行浓缩并喷雾干燥，或采用冷冻干燥等其他技术干制。
13、进一步地，所述s5中虚拟水解具体步骤如下：搜集苦荞蛋白氨基酸序列，使用biopep-uwm数据库对序列进行虚拟水解并预测所得肽的dpp-iv活性。
14、进一步地，所述s6中体外水解具体步骤如下：将s4所得过滤浆液在90-100℃加热10-15min，期间持续搅拌以确保蛋白完全受热变性；冷却至室温后，使用naoh或hcl调节溶液至蛋白酶最适ph值；按照酶底比：6000-10000u/g蛋白的添加量添加蛋白酶进行水解4-8h；水解完成后采用沸水浴加热，以终止水解反应。
15、进一步地，所述s7中序列鉴定的具体步骤如下：
16、取20-30ml冷却至室温的酶解液，在6000-8000rpm离心15-20min，取上清液进行冷冻干燥，采用lc-ms/ms进行序列鉴定。
17、进一步地，所述s8中筛选条件具体为分子对接、活性预测、理化性质预测、致敏性及毒性预测、氨基酸组成分布。
18、进一步地，所述s1中超声前处理包括以下步骤：
19、(1)优选和清洗：选取当年产优质苦荞，挑选出颗粒饱满的备用，并进行清洗晾干；
20、(2)消毒：将上述处理后的苦荞在5％-8％的次氯酸钠溶液中浸泡10-15min；
21、(3)超声前处理：将消毒后的苦荞置于功率为25khz的超声下连续超声12-16min。
22、进一步地，所述s2中间歇浸泡处理的具体过程为：将苦荞置于3％蔗糖溶液浸泡2-4h后取出通风6-9h；所述s3中间歇培养处理过程为：将浸麦后苦荞光照12h再黑暗处理12h。
23、进一步地，所述s5中蛋白酶选择碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶中的一或多种。
24、进一步地，所述s6中所选水解条件依据所述s5虚拟水解结果进行并确定，水解度的测定方法采用的是甲醛滴定法。
25、进一步地，所述s9中喷雾干燥进风温度170±10℃，出风温度80±5℃，雾化器转速15000r/min，进料速度70±5ml/min。
26、本专利技术具有如下优点：
27、1.本申请中的苦荞粉经过萌动处理及蛋白酶水解双技术联用，实现黄酮的高效转化的同时，最大限度提高了苦荞粉中dpp-iv抑制肽含量，实现了1+1＞2的降糖效果。
28、2.本申请以计算机虚拟水解结果为导向，简化体外酶解处理条件，解决现有技术中dpp-ⅳ抑制肽活性肽筛选利用不准确、不迅速的问题。
29、3.本申请对质谱鉴定后的多肽经分子对接、活性、毒性及理化性质等方法进行综合打分，获得dpp-iv抑制活性最强的3条新型肽段，分别为cppl、if、piw，均可与受体蛋白活性口袋内的tyr666、tyr662、glu206等氨基酸残基形成氢键作用力，这是三条多肽具有dpp-iv抑制活性的关键相互作用力。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种富含黄酮、DPP-Ⅳ抑制肽的协同降糖苦荞粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的富含黄酮、DPP-Ⅳ抑制肽的协同降糖苦荞粉的制备方法，其特征在于，所述S5中虚拟水解具体步骤如下：搜集苦荞蛋白氨基酸序列，使用BIOPEP-UWM数据库对序列进行虚拟水解并预测所得肽的DPP-IV活性。
3.如权利要求1所述的富含黄酮、DPP-Ⅳ抑制肽的协同降糖苦荞粉的制备方法，其特征在于，所述S6中体外水解具体步骤如下：将S4所得过滤浆液在90-100℃加热10-15min，期间持续搅拌以确保蛋白完全受热变性；冷却至室温后，使用NaOH或HCl调节溶液至蛋白酶最适pH值；按照酶底比：6000-10000U/g蛋白的添加量添加蛋白酶进行水解4-8h；水解完成后采用沸水浴加热，以终止水解反应。
4.如权利要求1所述的富含黄酮、DPP-Ⅳ抑制肽的协同降糖苦荞粉的制备方法，其特征在于，所述S7中序列鉴定的具体步骤如下：取20-30mL冷却至室温的酶解液，在6000-8000rpm离心15-20min，取上清液进行冷冻干燥，采用LC-MS/M
5.如权利要求1所述的富含黄酮、DPP-Ⅳ抑制肽的协同降糖苦荞粉的制备方法，其特征在于，所述S8中筛选条件具体为分子对接、活性预测、理化性质预测、致敏性及毒性预测、氨基酸组成分布。
6.如权利要求1所述的富含黄酮、DPP-Ⅳ抑制肽的协同降糖苦荞粉的制备方法，其特征在于，所述S1中超声前处理包括以下步骤：
7.如权利要求1所述的富含黄酮、DPP-Ⅳ抑制肽的协同降糖苦荞粉的制备方法，其特征在于，所述S2中间歇浸泡处理的具体过程为：将苦荞置于3％蔗糖溶液浸泡2-4h后取出通风6-9h；所述S3中间歇培养处理过程为：将浸麦后苦荞光照12h再黑暗处理12h。
8.如权利要求2所述的富含黄酮、DPP-Ⅳ抑制肽的协同降糖苦荞粉的制备方法，其特征在于，所述S5中蛋白酶选择碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶中的一或多种。
9.如权利要求3所述的富含黄酮、DPP-Ⅳ抑制肽的协同降糖苦荞粉的制备方法，其特征在于，所述S6中所选水解条件依据所述S5虚拟水解结果进行并确定，水解度的测定方法采用甲醛滴定法。
10.如权利要求1所述的富含黄酮、DPP-Ⅳ抑制肽的协同降糖苦荞粉的制备方法，其特征在于，所述S9中喷雾干燥进风温度170±10℃，出风温度80±5℃，雾化器转速15000r/min，进料速度70±5mL/min。
11.如权利要求1所述的富含黄酮、DPP-Ⅳ抑制肽的协同降糖苦荞粉的制备方法，其特征在于，所述S8中DPP-IV活性抑制肽序列为CPPL、IF、PIW。
...【技术特征摘要】
1.一种富含黄酮、dpp-ⅳ抑制肽的协同降糖苦荞粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的富含黄酮、dpp-ⅳ抑制肽的协同降糖苦荞粉的制备方法，其特征在于，所述s5中虚拟水解具体步骤如下：搜集苦荞蛋白氨基酸序列，使用biopep-uwm数据库对序列进行虚拟水解并预测所得肽的dpp-iv活性。
3.如权利要求1所述的富含黄酮、dpp-ⅳ抑制肽的协同降糖苦荞粉的制备方法，其特征在于，所述s6中体外水解具体步骤如下：将s4所得过滤浆液在90-100℃加热10-15min，期间持续搅拌以确保蛋白完全受热变性；冷却至室温后，使用naoh或hcl调节溶液至蛋白酶最适ph值；按照酶底比：6000-10000u/g蛋白的添加量添加蛋白酶进行水解4-8h；水解完成后采用沸水浴加热，以终止水解反应。
4.如权利要求1所述的富含黄酮、dpp-ⅳ抑制肽的协同降糖苦荞粉的制备方法，其特征在于，所述s7中序列鉴定的具体步骤如下：取20-30ml冷却至室温的酶解液，在6000-8000rpm离心15-20min，取上清液进行冷冻干燥，采用lc-ms/ms进行序列鉴定。
5.如权利要求1所述的富含黄酮、dpp-ⅳ抑制肽的协同降糖苦荞粉的制备方法，其特征在于，所述s8中筛选条件具体为分子对接、活性预测、理化性质预测、致敏性及毒性预测、氨...
【专利技术属性】
技术研发人员：王浩，王华，
申请(专利权)人：甘肃永鑫合农业科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。